文/胡姝敏 劉寶華 孫欣瑤 李曉東 王春潮

（1 黑龍江龍丹乳業(yè)科技股份有限公司；2 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院）

抗氧化劑在國(guó)內(nèi)外發(fā)展較快，在越來(lái)越廣泛的領(lǐng)域進(jìn)行應(yīng)用。Harman提出的自由基理論指出，過(guò)多的自由基會(huì)造成細(xì)胞受損害，如磷脂膜、蛋白損害和DNA損害，這和一些疾病息息相關(guān)，如肥胖癥、動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥等[1～3]。人們也有這樣的意識(shí)，即人體內(nèi)因氧化產(chǎn)生的自由基是導(dǎo)致人衰老和部分疾病的原因[4]，抗氧化劑應(yīng)用范圍廣，不僅可以用于食品中以延長(zhǎng)保質(zhì)期，而且可用于保健食品及化妝品中作為功能成分。抗氧化劑有繁多的種類，但是化學(xué)合成的抗氧化劑如BHA、BHT等使用受限，其使用不當(dāng)可以引起DNA損傷，且本身具有毒副作用[5，6]，為增加安全性，很多國(guó)家對(duì)抗氧化劑的添加量都規(guī)定了ADI值[7]。因此，人們逐漸開(kāi)始研究提取天然抗氧化劑，主要是從植物、動(dòng)物組織中提取，已研制出乳清蛋白肽、大豆多肽及肌肽等，根據(jù)其不同的功能性應(yīng)用于不同的產(chǎn)品中，如抗氧化肽、降膽固醇肽、降血壓肽、抗菌肽[8]等。活性肽是對(duì)機(jī)體健康有影響的特殊蛋白質(zhì)片斷，對(duì)促進(jìn)機(jī)體健康，防御疾病功能具有積極作用[9]，能使機(jī)體組織損傷降低到最小，其功能主要取決于所含的氨基酸組成和序列，可以添加到功能性食品或特殊的營(yíng)養(yǎng)應(yīng)用中[10]。

發(fā)酵方法相比于蛋白酶解法有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，微生物產(chǎn)酶的過(guò)程和酶水解蛋白的過(guò)程結(jié)合為一步，酶的分離和產(chǎn)物純化步驟被省去，生產(chǎn)成本也隨之降低。微生物產(chǎn)生的端肽酶對(duì)活性肽末端起到修飾的作用，因此小肽不但苦味降低，同時(shí)還有發(fā)酵產(chǎn)生的天然芳香味，有較好的適口性[11]。抗氧化肽能有效地清除體內(nèi)累積的自由基生物活性物質(zhì)，有效保護(hù)細(xì)胞及組織的生理功能。氧化與人類及其它動(dòng)物的許多疾病相關(guān)[12，13]，例如癌癥、衰老、心腦疾病等，適當(dāng)攝入具有抗氧化活性的物質(zhì)會(huì)起到預(yù)防疾病的作用。抗氧化肽能避免脂質(zhì)過(guò)氧化的發(fā)生，減緩油脂的氧化速率，延長(zhǎng)產(chǎn)品的保藏期。通過(guò)對(duì)抗氧化多肽的研究開(kāi)發(fā)，能夠?yàn)楦囝I(lǐng)域提供更安全、更可靠、抗氧化活性更高的抗氧化劑，為抗氧化多肽的進(jìn)一步研究提供依據(jù)，相信抗氧化多肽會(huì)有一個(gè)更廣闊的應(yīng)用前景。本研究主要是確定發(fā)酵菌種和優(yōu)化抗氧化多肽發(fā)酵工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)菌株：瑞士乳桿菌（lactobacillus Helveticas）CICC22818、CICC22815，干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）20538、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）22173、23119，來(lái)自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院重點(diǎn)試驗(yàn)室菌種保藏庫(kù)。

乳清濃縮蛋白（WPC80）：湖北欣和生物科技有限公司提供；DPPH：Sigma公司；甘氨酸：天津博迪化工股份有限公司；茚三酮：天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心。

1.2 儀器與設(shè)備

JD500-2電子天平：沈陽(yáng)龍騰電子稱量?jī)x器有限公司；85-2恒溫磁力加熱攪拌器：常州國(guó)華電器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴箱：上海比朗儀器有限公司；離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；UT-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；SYQ-DSX-280B手提式蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；PHS-3C精密pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

表1 甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

2 試驗(yàn)方法

2.1 菌株的篩選

2.1.1 產(chǎn)酸能力的測(cè)定

使用PHS-3C精密pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。pH計(jì)使用前應(yīng)分別使用pH值為4.01和6.88的標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液（20 ℃）進(jìn)行校準(zhǔn)。

2.1.2 活菌數(shù)的測(cè)定

在無(wú)菌操作下取5mL發(fā)酵樣品，加入45 mL無(wú)菌生理鹽水中，充分振蕩混勻，然后根據(jù)樣品中含菌量的不同，做10 倍系列不同濃度稀釋，取適當(dāng)梯度的稀釋液倒在MRS瓊脂平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，對(duì)菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)（以每mL樣品中的菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)）。

2.1.3 水解度的測(cè)定

水解度的測(cè)定[14]采用茚三酮顯色法，用甘氨酸的量計(jì)算。原理為：蛋白質(zhì)水解物和茚三酮發(fā)生顯色反應(yīng)生成藍(lán)色物質(zhì)，用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

（1）甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取0.1g干燥的甘氨酸，溶解定容至100 mL容量瓶中，再吸取2.00 mL溶液定容至100 mL容量瓶中，得到濃度為20 μg/mL的溶液。再以此溶液分別稀釋成甘氨酸含量為2～20 μg/mL的溶液用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（表1）。取稀釋液2.00 mL于試管中，加入1.00 mL顯色劑，混勻后沸水浴中加熱15 min，同時(shí)作空白試驗(yàn)，冷水冷卻后，加入5.0 mL 40%（V/V）乙醇溶液混勻，并放置15 min，用空白組在570 nm處調(diào)零，測(cè)定試驗(yàn)組的吸光值。（2）茚三酮顯色劑的配制

2 g茚三酮溶解于100 mL蒸餾水中，溶液置于棕色瓶中保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

（3）茚三酮法測(cè)定蛋白水解度

取蛋白水解液0.5 mL定容至50 mL容量瓶中，再?gòu)闹腥?.40 mL稀釋液于試管中，用蒸餾水稀釋5倍，加入1.00 mL茚三酮溶液，混勻后沸水浴15 min，同時(shí)作空白試驗(yàn)。根據(jù)測(cè)得的吸光度計(jì)算乳清濃縮蛋白水解度。

計(jì)算蛋白水解度公式如下：

其中：htot是指每克被裂解蛋白質(zhì)的肽鍵毫摩爾數(shù)，WPC htot=8.8（mmol/g）；6.25×N為乳清蛋白含量（g/L），采用凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定。

2.2 乳清蛋白抗氧化肽制作工藝的優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)

（1）乳清蛋白含量對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響

取適量乳清蛋白濃縮粉〔6%、8%、10%、12%、14%（W/V）〕，用去離子水配制，在63 ℃條件下滅菌30 min，冷卻到室溫，并按照2%的比例接種瑞士乳桿菌CICC 22818，在恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，于6 000 rpm條件下離心15 min，測(cè)定蛋白水解度，以蛋白水解度為指標(biāo)，并測(cè)定不同濃度的乳清濃縮蛋白對(duì)DPPH自由基清除能力的影響。

（2）發(fā)酵時(shí)間對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響

取適量乳清蛋白濃縮粉，加入去離子水配制成濃度為10%（W/V）的溶液，在63 ℃條件下滅菌30 min，冷卻到室溫，并按照2%的比例接種瑞士乳桿菌CICC 22818，在恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃條件下分別培養(yǎng)24、36、48、60、72 h，取20 mL加入離心管中，6 000 r/min離心15 min，測(cè)定蛋白水解度和DPPH自由基清除能力，研究發(fā)酵時(shí)間對(duì)蛋白水解度和DPPH自由基清除率的影響。

（3）接種量對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響

取適量乳清蛋白濃縮粉，加入去離子水配制成濃度為10%（W/V）的溶液，在63 ℃條件下滅菌30 min，冷卻到室溫，瑞士乳桿菌CICC 22818接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%，在恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃條件下分別培養(yǎng)24 h，取20 mL加入離心管中，6 000 r/min離心15 min，測(cè)定蛋白水解度和DPPH自由基清除能力，研究接種量對(duì)蛋白水解度和DPPH自由基清除率的影響。

（4）發(fā)酵溫度對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響

取適量乳清蛋白濃縮粉，加入去離子水配制成濃度為10%（W/V）的溶液，在63 ℃條件下滅菌30 min，冷卻到室溫，并分別按照2%比例接種瑞士乳桿菌CICC 22818，在恒溫培養(yǎng)箱中在37、40、43、45、50 ℃條件下分別培養(yǎng)24 h，取20 mL加入離心管中，6 000 r/min離心15 min，測(cè)定蛋白水解度和DPPH自由基清除率，研究溫度對(duì)蛋白水解度和DPPH自由基清除率的影響。

2.2.2 乳清濃縮蛋白發(fā)酵測(cè)定指標(biāo)

（1）水解度

測(cè)定方法見(jiàn)2.1.3。

（2）DPPH自由基清除能力

參考Shimada等[15]的方法進(jìn)行測(cè)定，原理為DPPH在乙醇中呈紫色，于517 nm處有強(qiáng)吸收能力，加入抗氧化劑后會(huì)褪色，其顏色變淺程度可反映抗氧化劑的抗氧化能力。將 DPPH用無(wú)水乙醇配成濃度為6.5×10-4mol/L的溶液，在冰箱存放，用時(shí)稀釋為6.5×10-5mol/L溶液。將1.0 mL 5.00 mg/mL蛋白水解液加入到2.0 mL DPPH溶液中，避光保存30 min后在517 nm處測(cè)定樣品吸光值。吸光值越低其抗氧化性越強(qiáng)。

2.2.3 抗氧化肽制備工藝的優(yōu)化

選擇發(fā)酵濃度、發(fā)酵時(shí)間、接種量、發(fā)酵溫度為變量，選定四因素三水平，Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用響應(yīng)面分析法分析試驗(yàn)，以DPPH自由基清除能力為指標(biāo)，對(duì)抗氧化肽工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并做驗(yàn)證試驗(yàn)。

2.3 乳清蛋白肽抗氧化性的測(cè)定

瑞士乳桿菌CICC 22818發(fā)酵乳清濃縮蛋白WPC 80，在最佳發(fā)酵條件下，即發(fā)酵溫度為43 ℃，發(fā)酵時(shí)間為60 h，接種量為3%，乳清蛋白濃度為10%時(shí)，以水解液的·OH自由基清除能力、還原力為指標(biāo)，測(cè)定蛋白發(fā)酵液的抗氧化能力，并與未優(yōu)化發(fā)酵條件的蛋白水解液對(duì)比抗氧化能力，檢測(cè)抗氧化性提高的情況。

2.3.1 ·OH自由基清除能力的測(cè)定

根據(jù)賈之慎等[16]方法對(duì)·OH自由基清除能力進(jìn)行測(cè)定。先取一定量的樣品，用磷酸緩沖溶液進(jìn)行溶解。取0.75 mmol/L鄰二氮菲無(wú)水乙醇溶液1 mL于試管中，加入0.15 mol/L磷酸緩沖液（pH值7.4）2 mL和蒸餾水1 mL，混勻后加入1 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液和1 mL雙氧水，37℃水浴60 min，測(cè)得損傷管吸光值A(chǔ)損。未損傷管以蒸餾水代替損傷管中的雙氧水，方法同上，測(cè)定未損傷管的吸光值A(chǔ)未。樣品管用樣品代替損傷管中的蒸餾水，在536 nm處測(cè)吸光值。按下列公式計(jì)算清除率。

2.3.2 還原力的測(cè)定

根據(jù)Oyaizu[17]方法對(duì)還原力進(jìn)行測(cè)定。取一定質(zhì)量濃度的乳清蛋白水解產(chǎn)物樣品溶液1.00 mL，加入2.00 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH值6.6）和1%鐵氰化鉀溶液各2.50 mL，50 ℃水浴20 min，然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸2.50 mL，3 000 r/min條件下離心10 min。取2.50 mL上清液和 0.50 mL三氯化鐵（0.1%，W/V）混合，10 min后在700 nm處測(cè)定吸光度A，A越大還原能力越強(qiáng)。

2.4 乳清濃縮蛋白發(fā)酵液的純化及凍干

2.4.1 超濾處理乳清濃縮蛋白發(fā)酵液

取乳清濃縮蛋白發(fā)酵液，在6 000 r/min條件下離心15 min，除去菌體及部分大分子物質(zhì)。取上清液超濾去除大分子物質(zhì)及鹽類等雜質(zhì)，乳清濃縮蛋白發(fā)酵液使用10 Ku截留分子量薄膜進(jìn)行超濾濃縮，超濾溫度為40 ℃，壓力為0.2 MPa，WPC濃度為10%。

2.4.2 乳清蛋白肽的冷凍干燥

先將多肽降溫使其凍結(jié)，然后用冷凍干燥機(jī)干燥樣品。具體操作如下：（1）取發(fā)酵得到的水解肽于專用平皿內(nèi)，在冰箱中冷凍直到成固體為止。（2）將冷凍好的發(fā)酵水解肽放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)，設(shè)置溫度維持在-45 ℃，真空度設(shè)置為20 Pa。（3）冷凍干燥24 h后取出。

2.5 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果表示為平均數(shù)±SD。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Statistix 8.1（分析軟件，St Paul，MN）軟件包中Linear Models程序進(jìn)行，差異顯著性（p＜ 0.05）分析使用Tukey HSD程序。采用sigmaplot12.5軟件作圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌種篩選指標(biāo)的研究

3.1.1 水解度

如圖1所示，以甘氨酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)建立吸光值y與游離氨基含量x之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為：y=0.04x+0.0015（R2=0.9992），線性良好，可用于計(jì)算乳清蛋白水解度。

3.1.2 乳清蛋白水解度

圖1 蛋白質(zhì)水解度標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 不同菌株的蛋白水解度測(cè)定

圖3 不同菌株在不同發(fā)酵時(shí)間的pH值測(cè)定

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間菌活力的測(cè)定

圖5 發(fā)酵期間CICC 22818的數(shù)量變化

不同菌株的蛋白水解度的測(cè)定結(jié)果如圖2。由圖可知，不同類型的菌株對(duì)乳清蛋白的水解能力有差別，在相同的條件下，菌株CICC 22818對(duì)乳清蛋白的水解能力最強(qiáng)，72 h內(nèi)，蛋白水解度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加。蛋白水解度關(guān)系到蛋白質(zhì)分解成小肽段的程度，對(duì)后續(xù)抗氧化肽的測(cè)定會(huì)有影響，應(yīng)優(yōu)先考慮水解蛋白能力強(qiáng)的菌株，因此選擇瑞士乳桿菌CICC 22818。

3.1.3 產(chǎn)酸能力

不同菌株在不同發(fā)酵時(shí)間的pH值的測(cè)定結(jié)果如圖3所示，由圖可知，在發(fā)酵一段時(shí)間后，各個(gè)菌種在發(fā)酵過(guò)程中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)不斷產(chǎn)酸，使得發(fā)酵液的pH值不斷下降，菌株的產(chǎn)酸能力逐漸增加，瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）CICC 22815和CICC 22818的pH值很接近，產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，pH值降低得最多，最后可達(dá)到3.97左右。其它菌株pH值也有相對(duì)的降低，但是幅度較小。

3.1.4 發(fā)酵過(guò)程中的菌活力

不同菌種不同發(fā)酵時(shí)間菌活力的測(cè)定結(jié)果如圖4所示，可以看出，不同的菌種發(fā)酵不同的時(shí)間檢測(cè)菌種的存活情況，菌種在發(fā)酵24 h有較強(qiáng)的活力，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，菌種的活力均逐漸下降，其中菌種CICC 22818在發(fā)酵乳清濃縮蛋白72 h仍保持8.5 LogCFU/g，顯著高于其它菌株。因此本試驗(yàn)選擇瑞士乳桿菌CICC 22818作為試驗(yàn)菌株。

3.1.5 瑞士乳桿菌CICC 22818的生長(zhǎng)曲線

在乳清蛋白發(fā)酵期間內(nèi)，定期取樣，測(cè)定其中瑞士乳桿菌CICC 22818的活菌數(shù)變化。結(jié)果如圖5所示，在發(fā)酵12 h時(shí)，CICC 22818的活菌數(shù)達(dá)到9.17 LogCFU/g，隨后在24 h時(shí)略有提高，可以達(dá)到9.2 LogCFU/g，之后在24～48 h內(nèi)活菌數(shù)又有所下降，但是下降幅度不明顯（P＞0.05），48 h后CICC 22818數(shù)量一直呈下降趨勢(shì)，但是84 h時(shí)活菌數(shù)仍接近8.45 LogCFU/g。

3.2 乳清蛋白抗氧化肽制備工藝的優(yōu)化

3.2.1 乳清蛋白發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)

（1）發(fā)酵溫度對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響

由圖6可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，蛋白水解度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，瑞士乳桿菌CICC 22818發(fā)酵作用需要在一定溫度范圍內(nèi)進(jìn)行，高溫或低溫都有礙反應(yīng)進(jìn)行，45 ℃時(shí)水解度達(dá)到最大。在最適溫度45 ℃時(shí)，DPPH自由基清除率也最高。隨著溫度的升高，菌活力會(huì)有所下降，蛋白質(zhì)裂解的肽鍵數(shù)減少，水解度緩慢下降，小分子肽也隨之減少，清除自由基能力受到限制。綜合蛋白水解度和DPPH自由基清除率，選取43～50℃為最佳溫度范圍，并進(jìn)行后續(xù)的優(yōu)化試驗(yàn)。

圖6 發(fā)酵溫度對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響

圖7 菌株接種量對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響

圖8 乳清蛋白含量對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響

在瑞士乳桿菌適應(yīng)的溫度范圍內(nèi)，菌株活力不受影響，乳清蛋白發(fā)酵過(guò)程中水解能力不受影響，并且隨著溫度的升高，蛋白水解能力增強(qiáng)，隨著蛋白水解程度的增加，乳清蛋白分解成小分子肽的量也逐漸增多，使得具備抗氧化能力的多肽對(duì)DPPH自由基的清除能力增強(qiáng)。

（2）接種量對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響

由圖7可知，隨著瑞士乳桿菌CICC 22818接種量的增加，乳清濃縮蛋白的水解度在發(fā)酵期間逐漸增大，原因是隨著菌株接種量的增加，菌體本身含有的酶的量也隨之累積，水解度也就相應(yīng)提高。但當(dāng)菌株接種量大于3%（V/V）時(shí)，隨著菌株接種量的增加，蛋白水解度逐漸減少。這主要是由于當(dāng)菌株接種量太低時(shí)，菌種活力低，因此蛋白分解能力差；當(dāng)添加量增加時(shí)，活菌數(shù)增加，在發(fā)酵過(guò)程中菌體細(xì)胞中的蛋白酶因菌體自溶而被釋放出來(lái)，因此加快了蛋白質(zhì)水解，使得蛋白質(zhì)被更多地分解成多肽，清除DPPH自由基能力的抗氧化肽量也增多。但當(dāng)菌株接種量過(guò)多時(shí)，產(chǎn)酸速率也相應(yīng)加快，較高的酸度環(huán)境會(huì)抑制菌種蛋白酶的活力，從而使得蛋白質(zhì)水解度降低，抗氧化肽含量減少，清除自由基能力變小。

（3）乳清蛋白含量對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響

由圖8可知，隨著乳清蛋白含量的增加，水解度先增加后減少，在8%達(dá)到最大。底物濃度剛開(kāi)始小，而菌的分解能力較強(qiáng)，使得底物供不應(yīng)求，所以水解度小，分解得到的多肽量也少；當(dāng)濃度達(dá)到一定時(shí)，菌在發(fā)酵時(shí)快速分解，底物與菌產(chǎn)生的酶等比發(fā)生反應(yīng)，水解度變大，自由基清除能力也增強(qiáng)，在蛋白濃度10%（M/V）左右時(shí)達(dá)到最大；當(dāng)?shù)孜餄舛冗^(guò)高時(shí)，反應(yīng)物小于底物濃度，菌株不能使蛋白完全分解，水解度下降。

（4）發(fā)酵時(shí)間對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響

由圖9可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，蛋白水解度先逐漸增大后減小，這主要是由于在一定發(fā)酵時(shí)間范圍內(nèi)，菌株的活性增強(qiáng)，蛋白質(zhì)水解能力較強(qiáng)，而當(dāng)發(fā)酵時(shí)間繼續(xù)增加，菌株產(chǎn)酸越多，較低的pH值環(huán)境降低了菌株的酶活性，導(dǎo)致蛋白水解量降低[18]。而在此過(guò)程中，隨著蛋白水解能力的增強(qiáng)，自由基的清除率也逐漸增加，但隨著時(shí)間的增加而越來(lái)越緩慢，這可能是由于蛋白水解到一定程度后，蛋白質(zhì)分解成小分子肽的速度變慢，使具有抗氧化能力的肽量也增加較慢。

3.2.2 BOX-Behnken優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)

本試驗(yàn)選擇接種量（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、溫度（C）、乳清蛋白含量（D）四個(gè)因子為自變量，以DPPH自由基清除率為響應(yīng)值，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)，建立BOX-Behnken模型，見(jiàn)表2。BOX-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，響應(yīng)值R表示DPPH自由基清除率。

圖9 發(fā)酵時(shí)間對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響

可以得出該試驗(yàn)的擬合方程為：

此方程式中，R為DPPH自由基清除率預(yù)測(cè)值，A、B、C和D分別為接種量、發(fā)酵時(shí)間、溫度和乳清蛋白含量的編碼值。對(duì)得到的四元二次回歸方程進(jìn)行方差分析和系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

該模型中p＜0.001，表明本研究所得的回歸模型方程極顯著，相關(guān)系數(shù)R2=93.40%，說(shuō)明該回歸方程的回歸效果較好，預(yù)測(cè)值與真實(shí)值之間具有高度相關(guān)性，DPPH自由基清除率的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值兩者之間擁有較好的擬合度。變異系數(shù)（CV）用于反映模型的置信度，CV值和置信度呈反比的關(guān)系，其值越低表示模型的置信度越高，本試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭蠧V值為6.17%，說(shuō)明此設(shè)計(jì)的模型可以較真實(shí)地預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果；失擬項(xiàng)P=0.7224＞0.05，表明不顯著，可以用該響應(yīng)面設(shè)計(jì)有效表示各因素之間的關(guān)系。模型的校正決定系數(shù)=86.79%，表明DPPH自由基清除率可以由該響應(yīng)面設(shè)計(jì)來(lái)解釋。綜上所述，該回歸方程的擬合度和可信度均較好，此方法可靠，可用于 DPPH自由基清除率的預(yù)測(cè)。

響應(yīng)面的優(yōu)化作用可以反映溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量和乳清蛋白含量對(duì)DPPH自由基清除率的影響，除此之外還能顯示兩個(gè)變量之間是否具有交互影響。由上表顯示，模型方程的一次項(xiàng)x3的P值小于0.0001，說(shuō)明接種量對(duì)DPPH自由基清除率的影響極顯著，x1、x2的P值0.0091、0.0010均小于0.05，說(shuō)明發(fā)酵時(shí)間和溫度對(duì)DPPH自由基清除率有顯著影響，x4的P值為0.0811＞0.05，差異不顯著。各因素對(duì)DPPH自由基清除率影響作用大小按次序依次是C＞B＞A＞D，即溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞接種量＞乳清非常顯著，說(shuō)明DPPH自由基清除率和各變量之間并不是線性關(guān)系那么簡(jiǎn)單，回歸方程模型項(xiàng)P值小于0.001，所以該模型非常顯著。各因素間兩兩互作對(duì)DPPH自由基清除率的影響響應(yīng)面圖如圖10所示。

如圖10所示，由相應(yīng)響應(yīng)面設(shè)計(jì)圖可以直觀地看出四種因素中每?jī)煞N因素交互作用對(duì)DPPH自由基清除率的影響不顯著。對(duì)比所有響應(yīng)面圖可知，圖10（4）交互的等高線最密，響應(yīng)面最陡，同時(shí)二者交互影響的F值大于其它因素兩兩交互影響的F值，且P值最小，因此二者交互作用對(duì)DPPH自由基清除率的影響最大。除此之外，發(fā)酵時(shí)間和乳清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的交互作用最小；如圖10（5）所示，曲面較平緩，同時(shí)方差分析得到二者交互作用的F值最小，說(shuō)明二者交互作用對(duì)自由基清除率的影響最小。因此各因素間交互作用可以忽略不計(jì)。上圖呈現(xiàn)情況與方差的分析結(jié)果一致。

表2 乳清蛋白發(fā)酵BOX-Behnken因素水平設(shè)計(jì)

表3 DPPH自由基清除率的BOX-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析

圖10 各因素交互作用的響應(yīng)曲面圖

3.3 最佳抗氧化肽制備工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

用模型的回歸方程求導(dǎo)數(shù)方程，并計(jì)算此導(dǎo)數(shù)方程的解，算出模型的最高點(diǎn)即最佳值，經(jīng)響應(yīng)面分析得出DPPH自由基清除率的四個(gè)因素的最佳水平值是發(fā)酵時(shí)間63 h、接種量3.4%、發(fā)酵溫度43.3 ℃、乳清蛋白濃度9.86%，響應(yīng)面最值的DPPH自由基清除率為26.4 %。為驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的可靠性，將響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化后的結(jié)果與實(shí)際值比較，按照上述優(yōu)化后參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到DPPH自由基清除率的實(shí)際值，將最佳條件修改為接種量3.5%、發(fā)酵時(shí)間63 h、發(fā)酵溫度43.3 ℃、乳清蛋白含量10%。驗(yàn)證試驗(yàn)最終顯示，DPPH清除率實(shí)際值為（27.52±0.26）%，實(shí)際值與預(yù)測(cè)值相差較小，證明該模型重現(xiàn)性好，進(jìn)一步驗(yàn)證了模型的可靠性。

為了得到較高的DPPH自由基清除率，本試驗(yàn)對(duì)主要影響因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在單因素的基礎(chǔ)上選取各因素的試驗(yàn)水平，通過(guò)響應(yīng)面設(shè)計(jì)得到DPPH自由基清除率的最優(yōu)參數(shù)為接種量3.5%、發(fā)酵時(shí)間63 h、發(fā)酵溫度43.3 ℃、乳清蛋白含量10%。

3.4 乳清蛋白肽抗氧化性的測(cè)定

自由基清除能力和鐵離子還原能力可以顯示瑞士乳桿菌發(fā)酵乳清蛋白得到的抗氧化鈦的抗氧化活性。發(fā)酵乳清蛋白制備的抗氧化肽純化并干燥后，對(duì)DPPH和·OH自由基的清除能力及還原能力分別為35.62%，20.58%，A=0.384。Liu等[19]以kefir發(fā)酵豆奶，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵可顯著增強(qiáng)豆奶的抗氧化活性，他們認(rèn)為在發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)降解為小分子的肽，從而增強(qiáng)了豆奶的抗氧化活性。Virtanen等[20]以多種乳酸菌發(fā)酵制備酸奶，結(jié)果表明發(fā)酵產(chǎn)品的抗氧化能力與其中蛋白質(zhì)的水解度成正比。此外，在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的氨基酸、乳酸及抗氧化性維生素都可增加蛋白質(zhì)的抗氧化活性。

4 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，相同發(fā)酵時(shí)間下，瑞士乳桿菌CICC 22818的菌株活力及蛋白水解能力較強(qiáng)，分別達(dá)到8.5 LogCFU/g、9.36%，為最適菌株。通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得出：在發(fā)酵乳清蛋白時(shí)，當(dāng)溫度為43.3 ℃、發(fā)酵時(shí)間為63 h、接種量為3.5%、乳清蛋白含量為10%時(shí)，DPPH自由基清除能力最大達(dá)到26.4%，經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)得出實(shí)際值為（27.52±0.26）%。綜上所述，瑞士乳桿菌發(fā)酵CICC 22818乳清蛋白制備乳清蛋白肽的最佳工藝為：接種量3.5%、發(fā)酵時(shí)間63 h、發(fā)酵溫度43.3 ℃、乳清蛋白含量10%。經(jīng)純化后的抗氧化肽的DPPH自由基清除率顯著提高，可達(dá)到35.62%，另外·OH自由基清除率為20.58%，同時(shí)也具有一定還原能力。

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