DP2拮抗劑抑制哮喘模型小鼠氣道炎癥的作用機制及與激素的比較

董樑 龔益 朱檸 張媛媛 夏敬文 陳小東

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是最常見的慢性疾病之一，目前全球至少有3億哮喘患者，在中國哮喘患者約有3 000萬[1-3]。隨著近年來空氣污染的加重，哮喘的平均患病率也呈逐步上升趨勢[4]。2006年第二期亞太地區哮喘認知和現狀(Phase 2 of the asthma insights and reality in Asia-pacific)調查結果顯示，亞太地區的哮喘患者只有2.5%達到了哮喘控制[5]。因此，如何更有效地控制哮喘已成為迫在眉睫的任務。

近來的研究發現哮喘的發生是固有免疫與適應性免疫相互作用、循環放大的結果，2型固有淋巴樣細胞(type 2 innate lymphoid cells, ILC2) 是將兩者連接在一起的紐帶[6]。前列腺素D2(prostaglandin D2, PGD2) 是一種重要的前列腺素類物質，由肥大細胞等炎癥細胞釋放，可引起血管擴張、支氣管強烈收縮，是過敏性疾病的重要調節介質[7-8]。PGD2通過三個G 蛋白偶聯受體起效，分別為：DP1(PGD2receptor 1)、DP2(PGD2 receptor 2)/Th2細胞上表達的化學趨向性受體同種分子( the chemoattractant receptor homologous molecule expressed on Th2cells receptor, CRTH2)和血栓素A2受體(thromboxane A2receptor, TP)。相關文獻報道PGD2可以通過結合ILC2表面受體促進它的遷移和細胞因子的分泌；而抑制PGD2的結合可以有效地限制ILC2的功能[9-10]。Fajt等[11]發現在重癥或未控制的哮喘患者中PGD2和CRTH2(即DP2)的表達明顯增多，說明DP2是PGD2的主要效應受體。因此，針對DP2拮抗劑的研究能幫助我們對哮喘患者進行更有效的治療，是十分必要的。

我們既往的研究已成功構建哮喘小鼠模型，并發現DP2拮抗劑能抑制哮喘小鼠IL-4和IL-5的水平[12-14]。本研究擬通過檢測哮喘小鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)細胞分類計數和肺組織DP1、DP2蛋白的表達情況，進一步了解DP2拮抗劑抑制哮喘小鼠氣道炎癥的作用機制并比較其同吸入激素作用的差異。

資料與方法

一、主要試劑與設備

WH-2000 臺式超聲霧化器，卵白蛋白(Sigma公司)，ProCyteDxTM全自動血細胞分析儀(IDEXX公司)，CRTH2抗體(ProSci公司)，DP1抗體(Abcam公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗(Jackson公司)，BCA 蛋白定量試劑盒、NC膜(Millipore公司)，BAYu3405( Cayman公司)。

二、實驗方法

1. 動物模型構建: 24只SPF級BALB/c小鼠，雄性(復旦大學醫學院實驗動物中心提供)，4～6周齡。隨機分為四組，每組 6 只：正常對照組(A組)、哮喘組( B 組)、吸入激素干預組(應用普米克令舒霧化， C組)、DP2 拮抗劑干預組(應用DP2拮抗劑BAYu3405干預，D 組)。B、C、D組小鼠分別于第0天、第7天、第14天腹腔注射卵白蛋白(OVA)與佐劑氫氧化鋁(AL(OH)3)致敏，于第 27至第29天以2% OVA生理鹽水20 ml霧化30 min；A組以生理鹽水代替OVA進行相同操作。C、D組在哮喘誘發的第27天起，予以給藥干預，C組每次激發前20 min均行普米克令舒霧化，霧化濃度為0.8 mg/L，霧化時間10 min，D組誘喘后2 h予以BAYu3405，5 mg/kg口服。所有動物在最后一次誘喘18～24 h后(第30天)處死。

2. 樣品采集: BALB/c小鼠用水和氯醛溶液麻醉后，剖開腹腔，顯露氣管后插管，在右肺門處鉗夾，行左肺支氣管肺泡灌洗，每次用生理鹽水0.1 ml，共2～3次，回收BALF，使用ProCyteDxTM全自動血細胞分析儀進行分析。

3. 肺組織的DP1和DP2western檢測： 小鼠處死后取右肺組織剪碎勻漿，冰上裂解30 min，4 ℃ 以離心半徑8 cm，12 000 r/min離心10 min取上清，采用BCA法測定蛋白濃度。取10 μg蛋白質樣品經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，蛋白轉移至NC膜上。以5%封閉液封閉1 h，加入一抗(DP1抗體，1︰1 000，CRTH2抗體，1︰1 000)4 ℃過夜，辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗(1︰8 000)室溫孵育1 h，采用ECL法顯影。掃描蛋白條帶，以β-actin為內參照進行半定量圖像分析，用灰度比值表示各組蛋白相對含量，實驗重復3次。

三、統計學方法

結 果

一、小鼠BALF中細胞分類變化

使用ProCyteDxTM全自動血細胞分析儀檢測A、B、C、D四組小鼠BALF的細胞分類。結果發現，與A組相比，B、C、D三組的白細胞(white blood cell，WBC)計數，中性粒細胞(neutrophils, NEU)計數和嗜酸性粒細胞(eosinophils , EOS)計數均有明顯增高(P<0.05)；EOS計數C、D兩組分別為(640±105)×103/ml和(580±149)×103/ml，較B組的(1 037±46)×103/ml均顯著降低(P<0.01)；C組的WBC計數為(1 187±160)×103/ml，低于B組的(1 797±150)×103/ml(P<0.01)，D組的WBC計數為(1 250±161)×103/ml，與B組有統計學差異(P<0.05)； B、C、D三組的NEU計數并未出現有統計學意義的變化，見圖1。

二、小鼠肺組織DP1和DP2 蛋白表達情況

Western blot 結果顯示A、C、D三組的DP1和DP2蛋白水平均顯著低于B組(P<0.01)；與A組相比，C組的DP2蛋白水平降低(P<0.05)，D組的DP2蛋白水平顯著下降(P<0.01)，C、D兩組之間亦有統計學上的差異(P<0.05)；A、C、D三組的DP1蛋白表達未出現有統計學意義的變化，見圖2。

討 論

2016年GINA指南指出哮喘是一種異質性疾病[15]，異質性是指同一疾病不同患者在個體上存在差異，這種個體差異是由不同的發病原因所致。哮喘的異質性通常包括哮喘表型和內型。表型主要包括患者的臨床和病理生理學特征等，其中一個非常重要的類型就是嗜酸性粒細胞型哮喘。有研究通過建立哮喘和變應性皮炎的動物模型證實在體內激活CRTH2受體能夠促進嗜酸性細胞浸潤并會加重疾病的病理生理改變[16]，而敲除CRTH2的小鼠出現氣道嗜酸性粒細胞減少和其他慢性過敏性炎癥反應的減輕[17]。本研究實驗亦有相同發現，使用OVA誘發后的各組小鼠EOS計數均高于對照組(P<0.05)，應用DP2拮抗劑干預后EOS計數較哮喘組顯著下降(P<0.01)。以上這些結果表明，PGD2通過其受體參與了以嗜酸性粒細胞募集為特點的過敏性疾病。

DP2又稱為CRTH2、GPCR44( G Protein Coupled Recptor 44)，主要表達在Th2細胞，嗜酸細胞和嗜堿細胞表面。BAYu3405是一種DP2和TXA2雙重受體拮抗劑[18]。Sugimoto等[19]表明口服BAYu3405(Ramatroban)能抑制PGD2誘導的體外EOS 遷移, 降低人類哮喘的氣道高反應性和小鼠、大鼠、豚鼠抗原誘導的早發相和遲發相免疫炎癥反應。Uller等[20]發現，用特異性受體拮抗劑TM30089，產生的效應與BAYu3405相同，推測BAYu3405是通過拮抗CRTH2受體而抑制嗜酸性粒細胞功能，并非通過TXA2受體作用所致。在本研究中，應用BAYu3405干預后，D組的DP2蛋白水平顯著下降，低于正常對照組水平(P<0.01)，這說明DP2拮抗劑通過抑制其蛋白表達水平發揮作用。

吸入激素是目前指南推薦治療哮喘的首選藥物，但事實上規律用藥的患者仍有20%難以控制癥狀。在本研究中發現，與哮喘組相比，激素干預與DP2拮抗劑均能顯著減少哮喘小鼠EOS計數、DP1和DP2蛋白含量(P<0.01)。但DP2拮抗劑較激素干預能更明顯地抑制DP2的蛋白表達(P<0.05)。因此我們猜想是否在將來可以將DP2檢測結果納入哮喘的個體化治療方案，使DP2拮抗劑成為哮喘治療的新選擇，這有待于進一步的臨床研究。

圖1 哮喘模型小鼠BALF細胞分類計數；注：A為白細胞計數；B中性粒細胞計數；C為嗜酸性粒細胞計數；圖中A組為正常對照組，B組為哮喘組，C組為哮喘干預1組(應用普米克令舒霧化)；D組為哮喘干預2組(應用DP2拮抗劑BAYu3405干預)。*與哮喘組比較，P<0.05，**與哮喘組比較，P<0.01

圖2 哮喘模型小鼠肺組織DP1和DP2蛋白表達；注：A為DP1的Western blot結果；B為DP2的Western blot結果；C為DP1與β-actin灰度比的統計條圖；D為DP2與β-actin灰度比值的統計條圖；圖中A組為正常對照組，B 組為哮喘組，C組為哮喘干預1組(應用普米克令舒霧化)，D 組為哮喘干預2組(應用DP2拮抗劑BAYu3405干預)。*兩組比較，P<0.05，**兩組比較，P<0.01

總之，本研究表明DP2作為PGD2的主要效應受體，參與以嗜酸性粒細胞募集為特點過敏性疾病。DP2拮抗劑能抑制哮喘模型小鼠氣道DP2蛋白表達水平,從而達到減少嗜酸性粒細胞浸潤，控制哮喘的作用。DP2拮抗劑對DP2蛋白表達的抑制作用強于吸入激素，或可作為新的藥物用于支氣管哮喘的治療。

參 考 文 獻

1 王長征. 改善支氣管哮喘控制現狀，需要重視患者的長期管理[J/CD]. 中華肺部疾病雜志(電子版), 2013, 6 (4): 296-298.

2 史文花, 李少軍, 劉璐, 等. 老年性支氣管哮喘的研究進展[J/CD]. 中華肺部疾病雜志(電子版), 2017, 10(4): 489-492.

3 Song WJ, Kang MG, Chang YS, et al. Epidemiology of adult asthma in Asia: toward a better understanding[J]. Asia Pac Allergy, 2014, 4(2): 75-85.

4 Guan WJ, Zheng XY, Chung KF, et al. Impact of air pollution on the burden of chronic respiratory diseases in China: time for urgent action[J]. Lancet, 2016, 388(10054): 1939-1951.

5 Wong GW, Kwon N, Hong J G, et al. Pediatric asthma control in Asia: phase 2 of the Asthma Insights and Reality in Asia-Pacific (AIRIAP 2) survey[J]. Allergy, 2013, 68(4): 524-530.

6 Martinez-Gonzalez I, Steer CA,Takei F. Lung ILC2s link innate and adaptive responses in allergic inflammation[J]. Trends Immunol, 2015, 36(3): 189-195.

7 陳亞娟, 文富強, 劉代順. PGD2/DP信號級聯調控哮喘氣道炎癥及重構的研究進展[J]. 臨床肺科雜志, 2007, 12(1): 59-61.

8 陳靈修, 冉丹華, 黃華萍, 等. 前列腺素D2受體調節PGD2誘導的人氣道黏液高分泌[J]. 基礎醫學與臨床, 2016, 36(1): 24-29.

9 Xue L, Salimi M, Panse I, et al. Prostaglandin D2activates group 2 innate lymphoid cells through chemoattractant receptor-homologous molecule expressed on TH2 cells[J]. J Allergy Clin Immunol, 2014, 133(4): 1184-1194.

10 Chang JE, Doherty TA, Baum R, et al. Prostaglandin D2regulates human type 2 innate lymphoid cell chemotaxis[J]. J Allergy Clin Immunol, 2014, 133(3): 899-901.

11 Fajt ML, Gelhaus SL, Freeman B, et al. Prostaglandin D(2) pathway upregulation: relation to asthma severity, control, and TH2 inflammation[J]. J Allergy Clin Immunol, 2013, 131(6): 1504-1512.

12 龔益, 董樑, 陳小東, 等. DP2拮抗劑對哮喘模型氣道炎癥的影響及與激素的比較[J]. 臨床肺科雜志, 2015, 20(5): 841-845.

13 劉海霞, 金先橋. 前列腺素D2及其受體CRTH2與支氣管哮喘的最新研究進展[J]. 國際呼吸雜志, 2014, 34(5): 354-359.

14 應延風, 李睿淳, 毛宇飛, 等. 大鼠支氣管哮喘模型中前列腺素D2水平和嗜酸粒細胞上受體改變研究[J]. 國際呼吸雜志, 2010, 30(23): 1417-1420.

15 Global Initiative for Asthma (GINA). GINA Report, Global Strategy for Asthma Management and Prevention. 2016. Available from: http://ginasthma.org/2016-gina-report-global-strategy -for-asthma-management-and-prevention/.Accessed June 2016.

16 Spik I, Brenuchon C, Angeli V, et al. Activation of the prostaglandin D2receptor DP2/CRTH2increases allergic inflammation in mouse[J]. J Immunol, 2005, 174(6): 3703-3708.

17 Satoh T, Moroi R, Aritake K, et al. Prostaglandin D2plays an essential role in chronic allergic inflammation of the skin via CRTH2receptor[J]. J Immunol, 2006, 177(4): 2621-2629.

18 Ishizuka T, Matsui T, Okamoto Y, et al. Ramatroban (BAY u 3405): a novel dual antagonist of TXA2 receptor and CRTh2, a newly identified prostaglandin D2receptor[J]. Cardiovasc Drug Rev, 2004, 22(2): 71-90.

19 Sugimoto H, Shichijo M, Iino T, et al. An orally bioavailable small molecule antagonist of CRTH2, ramatroban (BAY u3405), inhibits prostaglandin D2-induced eosinophil migration in vitro[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2003, 305(1): 347-352.

20 Uller L, Mathiesen JM, Alenmyr L, et al. Antagonism of the prostaglandin D2receptor CRTH2attenuates asthma pathology in mouse eosinophilic airway inflammation[J]. Respir Res, 2007, 8: 16.