晚期非小細胞肺癌EML4-ALK融合變異體與克唑替尼治療的臨床分析

張鶴 宋正波 呂鏜烽 陸志偉 吳娟 宋勇

肺癌是全球發生率和病死率最高的惡性腫瘤之一，其中85%肺癌為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)[1-3]，而且50%～60%在就診時已處于晚期[4]，而晚期NSCLC患者已失去了手術根治的機會。近幾年由于分子檢測的發展，晚期NSCLC的治療從以往基于組織病理學的細胞毒化療，轉變為以分子分型為基礎的分子靶向治療與放化療、抗血管和免疫治療相結合的治療新模式。在2007年，Soda等[5]發現間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)基因重排或融合是NSCLC另一種較為常見的分子亞型，ALK重排患者約占NSCLC的5%，其中棘皮動物微管相關類蛋白4(EML4)基因與ALK融合(EML4-ALK)為最常見類型[6-8]。克唑替尼作為第一代靶向藥用于ALK陽性的NSCLC患者，由于臨床研究結果表明其客觀有效率(objective response rate, ORR)高達約60%[9]，因此克唑替尼在ALK融合基因陽性晚期NSCLC患者的一線治療中占有首選地位[10]。 但是關于EML4-ALK融合基因，已有報道發現存在多種變異體，包括變異體1，2，3a，3b，4，5a和5b等[11]。根據目前的研究，ALK變異體之間是否與克唑替尼療效相關仍然存在爭議[11-14]。 因此，本研究收集來自皖南醫學院弋磯山醫院、南京大學醫學院臨床學院南京軍區南京總醫院自2013年9月至2017年5月收治的68例ALK陽性晚期NSCLC患者的臨床病理特征及服用克唑替尼的近期療效和不良反應進行分析，同時對于有足夠初治標本的患者進行二代測序，分析其EML4-ALK變異體的發生率和與克唑替尼療效的相關性，從而為克唑替尼的臨床進一步應用提供依據。

資料與方法

一、一般資料

本研究共納入68例患者，其中男性32例，女性36例，年齡28～62歲，中位年齡49歲；43例(63.2%)患者無吸煙史；美國東部腫瘤協作組體能狀況(Eastern Cooperative Oncology Group performance status, ECOG PS)評分為0～1分的患者有57例(83.8%)。60例(88.2%)患者的病理類型為腺癌；臨床分期包括ⅢB期4例，Ⅵ期64例。68例患者中，54例用Ventana ALK(羅氏，D5F3)融合蛋白IHC診斷ALK基因融合陽性，4例用FISH法檢測ALK陽性，10例用RT-PCR法檢測ALK陽性。38例患者既往接受過化療，30例患者一線服用克唑替尼。初治時伴有腦轉移患者有13例(19.1%)，見表1。

表1 68例患者的一般特征

二、病例納入標準和排除標準

1. 納入標準： ①經組織學或細胞學證實的ⅢB～Ⅵ期NSCLC；②經Ventana ALK免疫組化法(immunohistochemistry, IHC)或熒光原位雜交法(fluorescence in situ hybridization, FISH)或RT-PCR檢測ALK基因融合陽性；③至少有1個可測量的臨床病灶；④ECOG PS評分≤3分；⑤骨髓造血功能和肝腎功能基本正常。

2. 排除標準： ①患者任何可證實的嚴重心肺疾病；②患有嚴重的習慣性腹瀉或便秘，以及其他影響藥物吸收的消化系統疾病。

三、 治療方案及評估

1. 藥物治療： 患者口服克唑替尼膠囊250 mg/次，2次/d，直至出現任何疾病進展(progressive disease, PD)的客觀證據，或發生不可耐受的不良事件。

2. 二代測序： 收集肺癌患者甲醛固定石蠟包埋(FFPE)組織，從甲醛固定的石蠟切片中提取腫瘤DNA，并將其打斷，擴增，從而建立含目標基因的全基因組文庫。然后采用Illumina Hiseq 4000 (Illumina, San Diego, USA) 測序平臺進行測序，將得到的原始數據進行過濾并行生物信息學分析。

3. 近期療效： 根據實體瘤療效評價標準1.1(Response Evaluation Criteria in Solid Tumours1.1, RECIST 1.1)評價療效，分為完全緩解(complete response, CR)、部分緩解(partial response, PR)、疾病穩定(stable disease, SD)和疾病進展(progressive disease, PD)。客觀有效率(objective response rate, ORR)包括CR和PR; 疾病控制率(disease control rate, DCR)包括CR、PR、SD。

4. 不良反應評估： 按照美國國立癌癥研究所制定的通用毒性標準4.0(common toxicity criteria 4.0，CTC 4.0)評價不良反應，分為0～Ⅵ度共5個等級。

5. 隨訪： 68例患者均獲得隨訪。患者無進展生存期通過門診或電話隨訪獲得，末次隨訪時間為2017年10月30日。總生存期(overall survival, OS)指患者自首次治療起到患者死亡或末次隨訪的時間。無進展生存期(progression free survival, PFS)定義為患者自服用克唑替尼開始到明確疾病進展的時間。

四、統計學方法

應用SPSS19.0軟件進行統計學分析。對于不同亞組間療效比較應用χ2檢驗；對生存時間分析應用Kaplan-Meier、Log-rank和Cox回歸進行檢驗和多因素分析；P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

一、 NGS檢測結果

42例ALK陽性患者可獲取初治標本進行NGS檢測，其中35例(83.3%)檢測出ALK融合，7例患者未檢測出ALK陽性結果。35例EML4-ALK融合患者中，15例(42.9%)為變異體1(EX13︰EX20)，7例(20.0%)為變異體2(EX20︰EX20)，6例(17.1%)為變異體3(EX6︰EX20)，3例為變異體5(EX2:EX20)，1例為變異體7(EX14︰EX20)，3例為新變異體(EX13︰EX19；EX18︰EX17；EX21︰EX20)。

二、 臨床療效評價

68例患者治療28 d后評價療效，其中CR 4例，PR 38例，SD 16例，PD 10例。ORR達61.8%，DCR為85.3%。68例患者中位PFS為10.5個月(95% CI: 7.47 ～13.5個月)，中位OS為33.9個月 (95% CI: 25.85～42.08個月)。單因素和COX多因素回歸分析表明是否吸煙、性別、年齡、PS評分、是否腦轉移、是否一線使用克唑替尼是否影響PFS的獨立因素，結果顯示均沒有統計學差異(P>0.05)。

三、變異體與臨床療效分析

將35例EML4-ALK融合二代測序檢測結果分為變異體1(15例)和非變異體1(20例)兩組，其中兩組在性別、年齡、吸煙、PS評分、既往化療、是否腦轉移均沒有差異(P>0.05)，見表 2。35例患者中位PFS為10.7個月(95% CI: 8.22～13.23個月)，中位OS為27.3個月(95% CI: 17.40～37.25個月)。變異體1和非變異體1兩組的中位PFS分別是10.7個月和9.8個月，無統計學差異(P=0.647)，見圖1。兩組的中位OS無統計學差異(27.33個月vs. 22.40個月，P=0.831)。

圖1 35例EML4-ALK變異體1和非變異體1患者的中位PFS比較(10.7vs. 9.8個月，P=0.647)

四、不良反應

克唑替尼治療的主要不良反應是視覺影響和消化道反應；共25例(36.8%)患者發生視覺閃爍；惡心嘔吐發生率為30.9%(21/68)，腹瀉發生率為26.5%(18/68)；共17例(25.0%)患者有輕度肝功能異常；6例患者出現雙下肢浮腫。2例患者出現骨髓抑制；3例患者出現竇性心動過緩，但未觀察到Q-T間期延長。1例患者因Ⅱ度食管潰瘍減量至200 mg/次，2次/d。Ⅲ～Ⅳ度不良反應發生率較低，3例患者出現了Ⅲ～Ⅳ度肝功能異常。1例患者因間質性肺炎而停藥，見表3。

表2 35例患者EML4-ALK變異體的一般特征[n(%)]

表3 68例患者克唑替尼治療后的不良反應

討 論

目前，精準個體化治療已經成為肺癌治療的研究熱點，對于有驅動基因陽性的患者，相對應的靶向藥物成為治療的首選。EML4-ALK基因融合繼EGFR基因突變之后常見于非小細胞肺癌的患者，而針對EML4-ALK重排的第一代靶向藥物就是克唑替尼[15]。克唑替尼是口服的小分子多靶點酪氨酸激酶抑制劑，是全球首個針對ALK融合基因開發的分子靶向藥物，也是第一代ALK-TKI，對ALK和c-MET具有高選擇性抑制作用[16]。PROFILE1029的研究是對比培美曲塞聯合順鉑化療一線治療ALK陽性患者，該研究約90%受試者來自中國，研究結果顯示克唑替尼的PFS比化療明顯延長(11.1個月vs. 6.8個月，P<0.001)，兩組的ORR分別是88%和46%。但是，在ALK陽性的患者中療效不盡相同，存在個體化差異，探索療效差異也是目前臨床的熱點。其中一個方面，已經發現EML4-ALK融合基因存在多種變異體，至少有15種變異體的存在[17]，根據研究表明不同變異體的表達對療效可能有一定的影響，但是何種變異體對克唑替尼的治療有影響仍然存在爭議。因此，本研究在分析克唑替尼治療ALK陽性患者的療效和安全性的同時，利用二代測序技術進一步探究EML4-ALK變異體對克唑替尼的療效是否存在影響。

本研究中，克唑替尼治療ALK陽性患者的ORR是61.8%，中位PFS為10.5個月，以及中位OS為33.9個月。克唑替尼作為二線治療的隨機Ⅲ期臨床研究PROFILE1007顯示克唑替尼的中位PFS為7.7個月[18]，ORR達65%。作為一線治療的隨機Ⅲ期臨床研究PROFILE1014和PROFILE1029分別顯示克唑替尼治療的中位PFS為10.9個月和11.1個月，ORR分別是74%和88%。本研究中38例患者既往接受過化療，但其臨床療效仍與既往報道類似，克唑替尼與傳統化療治療的方案在ALK陽性晚期NSCLC治療上具有明顯優勢。

在2010年第一次有文獻報道有關在ALK變異體患者中采用克唑替尼治療的療效分析[19]，但發現了1例變異體2的患者。隨后有幾項回顧性的研究探索了變異體與克唑替尼之間的療效。Yoshida等[14]用RT-PCR的方法對35例使用克唑替尼治療的患者進行檢測，發現ALK變異體1最常發生(54%)，然后是變異體2(14%)和變異體3(12%)，在療效分析中顯示變異體1與非變異體1相比，不僅ORR更高(74%vs. 63%)，中位PFS也明顯延長，并且有統計學差異(11.0個月vs. 4.2個月，P<0.05)。Lei等[16]的研究發現克唑替尼的療效與變異體之間沒有相關性，他們將61例患者分成3組，變異體1、變異體3和其他變異體，3組的中位PFS分別是11.0個月、10.9個月和7.4個月(P=0.795)。Cha等[20]的研究納入52例ALK陽性患者，發現變異體1最常見(19.2%)，其次是變異體3a/b占19.2%，變異體2占5.8%。上述研究表明變異體之間與克唑替尼的療效沒有差異。此外，在Woo等[13]研究中，他們利用RT-PCR方法檢測54例晚期ALK陽性患者，變異體3a/b是最常見類型(44.4%)，其次是變異體1(33.3%)和變異體2(11.1%)，而在ALK-TKI(克唑替尼、色瑞替尼、艾樂替尼)治療的2年生存率(26.4%vs. 76.0%，P=0.034)和2年PFS率(32.7%vs. 69.0%，P=0.108)均是變異體3a/b低于變異體1/2/其他，這提示變異體3可能和ALK抑制劑的耐藥相關。在本研究中，變異體1和非變異體1兩組的中位PFS(10.7個月和9.8個月，P=0.647)和兩組的中位OS(27.33個月vs. 22.40個月，P=0.831)均沒有差異。因此，我們認為ALK抑制劑與EML4-ALK融合基因中的療效相關性仍未有定論，也可能與不同研究納入的患者接受ALK抑制劑治療的線數不同影響結果有關。在將來可以采用擴大樣本量進行前瞻性研究，同時采用高通量測序，進一步了解是否變異體之間的不同會伴有不同的其他基因突變影響抑制劑的療效，尚值得進一步探索。

在不良反應方面，本研究中克唑替尼主要是視覺影響(36.8%)和消化道的不良反應，包括惡心嘔吐(30.9%)和腹瀉(26.5%)，且均為輕度，與之前的一些研究報道的常見不良反應類似[9-10,18]。此外，在克唑替尼治療過程中出現少數患者(25.0%)肝功能異常，主要體現在轉氨酶升高，但轉氨酶升高通常是可逆的，經對癥治療后仍能以同樣劑量繼續治療，但需要在治療中關注。報道表明應用克唑替尼可發生Q-T間期延長和心動過緩等心律失常，但本研究中未有Q-T間期延長發生，僅3例出現心動過緩，且在未出現不能耐受的情況仍繼續治療。另一方面，僅1例患者出現Ⅱ度食管潰瘍在減量200 mg bid后能繼續接受治療。1例患者因間質性肺炎而停藥。因此，克唑替尼的治療是具有較好的安全性，大多數患者均能耐受。

本研究尚存在一定的局限性，對于二代測序的例數仍較小樣本，尚需要更大樣本量的研究探索。此外利用二代測序中有7例患者未檢測出ALK融合，這可能與腫瘤異質性相關。今后，可以選擇合適的病例、搜集足夠的大樣本并利用高通量測序，設計研究來進一步證實ALK陽性在我國患者中變異體的最常見類型以及與ALK抑制劑的相關性。

總之，對于ALK陽性晚期NSCLC患者可選擇克唑替尼作為首選治療，其療效明顯，不良反應可耐受。EML4-ALK變異體之間與克唑替尼的相關性不明顯，尚需要大樣本的研究進一步驗證。

參 考 文 獻

1 錢桂生. 肺癌不同病程類型發病率的變化情況及其原因[J/CD]. 中華肺部疾病雜志: 電子版, 2011, 4(1): 1-6.

2 李羲, 錢桂生. 肺癌臨床的罕見表現[J/CD]. 中華肺部疾病雜志: 電子版, 2013, 6(1): 4-7.

3 Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2017[J]. CA Cancer J Clin, 2017, 67(1): 7-30.

4 Ettinger D, Bepler G, Bueno R, et al. Non-small cell lung cancer clinical practice guidelines in oncology [J]. J Natl Compr Canc Netw, 2006, 4(6): 548-582.

5 Soda M, Choi Y, Enomoto M, et al. Identification of the transforming EML4-ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer [J]. Nature, 2007, 448(7153): 561-566.

6 Hong M, Kim RN, Song JY, et al. HIP1-ALK, a novel fusion protein identified in lung adenocarcinoma[J]. J Thorac Oncol, 2014, 9(3): 419-422.

7 Ou SH, Bartlett CH, Mino-Kenudson M, et al. Crizotinib for the treatment of ALK-rearranged non-small cell lung cancer: a success story to usher in the second decade of molecular targeted therapy in oncology[J]. Oncologist, 2012, 17(11): 1351-1375.

8 Takeuchi K, Choi YL, Togashi Y, et al. KIF5B-ALK, a novel fusion onco-kinase identified by an immunohistochemistry-based diagnostic system for ALK-positive lung cancer [J]. Clin Cancer Res, 2009, 15(9): 3143-3149.

9 Crino L, Kim D, Riely GJ, et al. Initial phase Ⅱ results with crizotinib in advanced ALK-positive non-small cell lung cancer (NSCLC): PROFILE 1005[J]. J Clin Oncol, 2011, 29(suppl 1): 7514-7514.

10 Solomon BJ, Mok T, Kim DW, et al. First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer[J]. N Engl J Med, 2014, 371(23): 2167-2177.

11 Takeuchi K, Choi Y L, Soda M, et al. Multiplex reverse transcription-PCR screening for EML4-ALK fusion transcripts[J]. Clin Cancer Res, 2008, 14(20): 6618-6624.

12 Lei YY, Yang JJ, Zhang XC, et al. Anaplastic lymphoma kinase variants and the percentage of ALK-Positive tumor cells and the efficacy of crizotinib in advanced NSCLC[J]. Clin Lung Cancer, 2016, 17(3): 223-231.

13 Woo CG, Seo S, Kim SW, et al. Differential protein stability and clinical responses of EML4-ALKfusion variants to various ALK inhibitors in advanced ALK-rearranged non-small cell lung cancer[J]. Ann Oncol, 2016, 28(4): 791-797.

14 Yoshida T, Oya Y, Tanaka K, et al. Differential Crizotinib response duration among ALK fusion variants in ALK-Positive Non-Small-Cell Lung Cancer[J]. J Clin Oncol, 2016, 34(28): 3383-3389.

15 劉春花, 宋勇. 克里唑替尼在非小細胞肺癌治療中的研究進展[J/CD]. 中華肺部疾病雜志: 電子版, 2014, 7(1): 91-93.

16 Christensen J, Zou H, Arango M, et al. Cytoreductive antitumor activity of PF-2341066, a novel inhibitor of anaplastic lymphoma kinase and c-Met, in experimental models of anaplastic large-cell lymphoma[J]. Mol Cancer Ther, 2007, 6(12): 3314-3322.

17 Horn L, Pao W. EML4-ALK: Honing in on a new target in non-small-cell lung cancer[J]. J Clin Oncol, 2009, 27(26): 4232-4235.

18 Shaw A, Kim D, Nakagawa K, et al. Crizotinib versus chemotherapy in advanced ALK-positive lung cancer[J]. N Engl J Med, 2013, 368(25): 2385-2394.

19 Kwak EL, Bang YJ, Camidge DR, et al. Anaplastic lymphoma kinase inhibition in non-small-cell lung cancer[J]. N Engl J Med, 2010, 363(18): 1693-1703.

20 Cha YJ, Kim HR, Shim HS. Clinical outcomes in ALK-rearranged lung adenocarcinomas according to ALK fusion variants[J]. J Transl Med, 2016, 14(1): 296.