非小細胞肺癌環狀RNA表達譜的差異分析

張韶巖 曾小莉 郭琳 區頌雷 馬旭晨

肺癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，其發病率居常見惡性腫瘤的第2位，病死率居癌癥死亡原因首位[1-2]，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)約占所有肺癌的80%，主要的病理類型是腺癌和鱗癌。探索NSCLC的生物學特征和發病機制，尋找診斷NSCLC的分子標志物是目前的研究熱點[3-4]。環狀RNA(circular RNA, circRNA)是廣泛存在于哺乳動物細胞中的一種新的內源性非編碼RNA分子，呈封閉環狀，比線性RNA更穩定，具有一定的保守性、組織和疾病特異性[5]。研究發現circRNA的表達異常與腫瘤的發生發展、侵襲轉移及放療耐受有著密切聯系，因此circRNA在腫瘤診斷和治療方面具有廣闊的應用前景[6-11]。但目前尚無NSCLC腫瘤組織中circRNA表達情況的相關研究。本研究應用circRNA芯片技術，對NSCLC組織與對應癌旁組織中差異表達的circRNA進行篩選，為進一步研究circRNA在NSCLC發生發展中的作用提供實驗依據。

資料與方法

一、一般資料

收集2016年10至11月于首都醫科大學附屬北京安貞醫院進行手術的NSCLC患者病理組織標本3例，其中男2例，女1例，年齡58～67歲，平均年齡63歲；根據病理診斷，肺腺癌2例，肺鱗癌1例；根據TNM分期，Ⅰ期1例、Ⅱ期1例、Ⅲ期1例。組織標本分別取自NSCLC原發腫瘤組織、距腫瘤邊緣≥5 cm的癌旁組織，共6組取標本后立即置于液氮中速凍，然后轉移到-80 ℃凍存。本研究符合本院倫理委員會的醫學倫理要求。

二、納入標準及排除標準

納入標準：①年齡大于18歲；②經病理組織檢查確診為NSCLC者；③手術治療前血常規、肝腎功能、心電圖檢查達治療要求；④手術治療前無嚴重合并癥。排除標準：①無病理學診斷，TNM分期不詳；②手術前接受過化療或放療；③存在其他腫瘤；④患者依從性差，不能配合研究者。

三、研究方法

1. 標本總RNA的提取： 按照TRIzol試劑盒(Invitrogen公司，美國)說明，分別提取3例NSCLC患者癌組織與對應癌旁組織中的總RNA，首先測定提取的RNA在260、280、230 nm處的吸光度值，計算濃度并估算純度。然后采用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳方法檢測RNA的純度及完整性。

2. circRNA芯片檢測： ①cDNA合成和標記：首先使用RNaseR (Epicentre公司，美國)除去標本總RNA中的線性RNA，然后采用Super RNA Labeling(Arraystar公司，美國)方法對RNA進行cDNA擴增和熒光標記；② 芯片雜交：首先將標記后的樣品與Human circRNA Array V2(8×15K)芯片(Arraystar公司，美國)進行排列雜交，然后用清洗液試劑盒(Agilent公司，美國)進行清洗。由上海康成生物公司提供circRNA芯片檢測、圖像采集、數據分析等。

三、數據分析

應用G2505C基因芯片掃描儀(Agilent公司，美國)掃描各標本Cy3熒光強度，然后采用Agilent Feature Extraction software (version 11.0.1.1)進行數據分析，并且使用R軟件包對數據進行歸一化處理。根據癌組織樣本和癌旁組織樣本間circRNA的變化倍數和P值篩選差異表達的circRNA，以變化倍數>2倍，配對t檢驗P值<0.05為陽性結果。對芯片篩選出的差異表達circRNA作進一步數據分析包括層次聚類分析、繪制散點圖和火山圖。通過TargetScan[12]和miRanda[13]兩個軟件對每種差異circRNA分別預測其最可能結合的miRNA，取匹配值較高的5個miRNA，并對這5個miRNA的結合位點進行預測和注釋。

結 果

一、總RNA的質量分析

6組標本中提取的RNA的D(260 nm)/D(280 nm)比值在1.8～2.0之間，D(260 nm)/D(230 nm)>1.8。電泳圖顯示總RNA的28 s、18 s條帶清晰，且28 s條帶亮度是18 s的2倍以上，5 s 條帶模糊。結果表明提取總RNA的質量與純度符合要求，可用于下一步實驗分析，見圖1。

圖1 組織樣本的總RNA 電泳圖；注：1～3： 非小細胞肺癌腫瘤組織；4～6： 癌旁組織

二、利用盒型圖分析原始樣本中circRNA表達情況

所有標本的芯片數據經過歸一化處理后，使用盒型圖可以直觀了解到circRNA表達分布情況在6組標本中幾乎是相同的，可進行下一步數據分析，見圖2。

圖2 3例非小細胞肺癌癌組織(C)與對應癌旁組織(A)中circRNA表達情況；注：C1～C3： 非小細胞肺癌組織；A1～A3： 癌旁組織

三、層次聚類分析

按照各組標本circRNA表達量的高低不同進行監督性層次聚類分析，從而將各組標本進行分類。圖中紅色表示circRNA表達量相對高，綠色表示circRNA表達量相對低，顯示差異表達的circRNA能將癌組織與癌旁組織區分開來，見圖3。

圖3 3例非小細胞肺癌癌組織(C)與對應癌旁組織(A)差異表達的circRNA層次聚類分析；注：C1～C3： 非小細胞肺癌組織；A1～A3： 癌旁組織

四、差異表達的circRNA圖形分析

對篩選出差異表達的circRNA進行圖形分析，繪制散點圖和火山圖。散點圖表示癌組織和癌旁組織circRNA總體分布集中趨勢，圖中分布于line1上方和line3下方的circRNA差異倍數達2倍以上，且有統計學意義(P<0.05)，分別表示circRNA表達上調和表達下調的分布情況，見圖4。

圖4 非小細胞肺癌癌組織與癌旁組織差異表達的circRNA 繪制的散點圖；注：線1(line 1)上方和線3(line 3)下方散點代表的circRNA差異倍數達2倍以上且P<0.05

采用火山圖進行差異表達circRNA的篩選，圖中紅色區域代表circRNA的差異倍數達2倍以上，且有統計學意義(P<0.05)，見圖5。

圖5 非小細胞肺癌癌組織(C)與癌旁組織(A)差異表達的circRNA 繪制的火山圖；注：紅色區域代表的circRNA差異倍數達2倍以上且P<0.05

五、差異表達的circRNA

比較癌組織及癌旁組織中circRNA的變化倍數和P值，篩選出差異表達2倍以上且具有統計學意義的circRNA共171種，其中高表達的有148種，表達差異達3倍以上的37種；低表達的有23種，表達差異達3倍以上的有2種，見表1，表2。每種差異circRNA分別預測出其結合匹配值較高的5個miRNA，見表3。

表1 癌組織相對癌旁組織上調表達差異3倍以上的circRNA

表2 癌組織相對癌旁組織下調表達差異3倍以上的circRNA

表3 差異表達的circRNA 的miRNA 結合位點

討 論

非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)是一類不具備編碼蛋白功能的RNA轉錄本，包括微小RNA(microRNA, miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)和circRNA等[14-16]。ncRNA曾經被認為是基因無用的噪音，然而近年來研究表明ncRNA在表觀遺傳學、轉錄調控及轉錄后調控中發揮重要作用[17]，特別是在腫瘤的發生、發展、轉移及預后等方面扮演重要角色[18]。Peng等[19]綜述了目前與肺癌相關的16種lncRNA的功能及其作用機制，提示lncRNA有可能作為肺癌有效的生物學標志物，并提供新的治療靶點。

circRNA是一種特殊的內源性ncRNA，隨著高通量測序技術和生物信息學的快速發展， circRNA的研究已逐漸從零星到系統化，成為目前RNA研究的熱點。circRNA能夠作為miRNA海綿，通過與miRNA結合來阻礙miRNA與mRNA靶點結合，進而抑制miRNA功能[20]，或者參與調節miRNA，降低miRNA的活性，從而在miRNA調控的疾病中發揮重要作用[21-22]。本研究對NSCLC篩選出的每種差異circRNA分別預測出其結合匹配值較高的5個miRNA，這些circRNA是否能通過結合相關miRNA的結合位點，從而影響NSCLC的發生發展尚有待進一步研究。

近年來國內外研究證實circRNA在人類腫瘤中表達異常，研究報道在喉癌中發現了698種表達量明顯變化的circRNA[6]，Sand等[23]在基底細胞癌中發現了23個高表達和48個低表達的circRNA。Li等[7]應用兩個circRNA公共數據庫資源篩選出目標circRNA(hsa-circ-002059)，發現其在胃癌中異常低表達，與癌癥遠處轉移情況、TMN分期、性別及年齡呈顯著相關。Wang等[8]發現circRNA(hsa-circ-001988)在結腸癌組織中低表達，且表達水平與結腸癌細胞分化和嗜神經侵襲顯著相關。Shang等[9]發現circRNA(hsa-circ-0005075)在肝癌組織中呈高表達，并與腫瘤大小顯著相關。研究表明circRNA在食管癌中表達量異常[10-11]，circRNA ITCH可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路而對食管癌和肺癌有抑制效應[24-25]。但目前尚無NSCLC腫瘤組織中circRNA表達情況的研究報道。

本研究采用高通量circRNA芯片對NSCLC癌組織與癌旁組織的表達譜變化進行篩選，結果發現差異表達的circRNA共有171種，高表達的circRNA有148種，低表達的有23種，其中高表達差異3倍以上的37種，低表達差異3倍以上的有2種。初步分析差異表達的circRNA具有miR-21、miR-22、miR-29、miR-129、miR-143、miR-150和miR-200的潛在位點，大量研究證實這些miRNA在NSCLC發生發展中發揮重要調控作用。我們前期研究發現NSCLC患者外周單個核細胞中miR-143表達顯著降低，miR-150在肺腺癌中表達量明顯高于肺鱗癌，提示miR-143、miR-150與NSCLC相關，有可能作為鑒別診斷NSCLC的分子標志物[26]。本研究發現hsa_circRNA_100352在癌組織(相對于癌旁組織)中顯著上調，hsa_circRNA_102062在癌組織(相對于癌旁組織)中顯著下調，分別具有miR-143和miR-150的潛在位點，并且這兩種circRNA都是外顯子circRNA。本研究還對circRNA上的保守miRNA的結合位點進行預測分析，推測hsa_circRNA_100352和hsa_circRNA_102062可能通過與miR-143和miR-150結合來調控靶基因的表達，在NSCLC的發生發展中可能發揮重要作用。但是，由于本篩選研究標本數量較少，有其局限性，還需要大樣本的臨床驗證研究和基礎研究加以證實。進一步探討目標circRNA與NSCLC病理類型、分期和轉移的關系，深入研究目標circRNA參與NSCLC發生發展的過程及其作用機制，可為NSCLC的早期診斷、靶向治療以及預后判斷提供新的思路。

參 考 文 獻

1 錢桂生. 肺癌不同病理類型發病率的變化情況及其原因[J/CD]. 中華肺部疾病雜志(電子版), 2011, 4(1): 1-5.

2 Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2016[J]. CA Cancer J Clin, 2016, 66(1): 7-30.

3 呂艷玲, 袁冬梅, 金淑賢, 等. 非小細胞肺癌患者癌胚抗原、C反應蛋白表達水平與預后的關系[J/CD]. 中華肺部疾病雜志(電子版), 2016, 9(2): 140-144.

4 張邵巖, 曾小莉, 區頌雷, 等. 肺癌患者血清多效蛋白表達水平及其臨床意義[J/CD]. 中華肺部疾病雜志: 電子版, 2017, 10(3): 292-295.

5 Guo JU, Agarwal V, Guo H, et al. Expanded identification and characterization of mammalian circular RNAs[J]. Genome Biol, 2014, 15(7): 409.

6 Xuan L, Qu L, Zhou H, et al. Circular RNA: a novel biomarker for progressive laryngeal cancer[J]. Am J Transl Res, 2016, 8(2): 932-939.

7 Li P, Chen S, Chen H, et al. Using circular RNA as a novel type of biomarker in the screening of gastric cancer[J]. Clinica Chimica Acta, 2015, 444:132-136.

8 Wang X, Zhang Y, Huang L. et al. Decreased expression of hsa_circ_001988 in colorectal cancer and its clinical significances[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(12): 16020-16025.

9 Shang X, Li G, Liu H, et al. Comprehensive circular RNA profiling reveals that hsa_circ_0005075, new circular RNA biomarker, is involved in hepatocellular carcinoma development[J]. Medicine (Baltimore), 2016, 95(22): e3811.

10 Xia W, Qiu M, Chen R, et al. Circular RNA has_circ_0067934 is upregulated in esophageal squamous cellcarcinoma and promoted proliferation[J]. Sci Rep, 2016, 6: 35576.

11 Su H, Lin F, Deng X, et al. Profiling and bioinformatics analyses reveal differential circular RNA expression in radioresistant esophageal cancer cells[J]. J Transl Med, 2016, 14(1): 225.

12 Enright A, John B, Gaul U, et al. MicroRNA targets in drosophila[J]. Genome Biology, 2003, 5(1): R1.

13 Pasquinelli AE. MicroRNAs and their targets: recognition, regulation and an emerging reciprocal relationship[J]. Nat Rev Genet, 2012, 13(4): 271-282.

14 夏世金, 高文, 胡明冬, 等. 環狀RNA的研究現狀及展望[J/CD]. 中華肺部疾病雜志: 電子版, 2014, 7(6): 670-2673.

15 田芳, 王云, 肖哲, 等. 環狀RNA CircHIPK3通過miR-379調控IGF1表達促進非小細胞肺癌細胞系 NCI-H1299與NCI-H2170的細胞增殖[J]. 中國肺癌雜志, 2017, 20(7): 459-467.

16 Memczak S, Jens M, Elefsinioti A, et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency[J]. Nature, 2013, 495(7441): 333-338.

17 Guttman M, Rinn JL. Modular regulatory principles of large non-coding RNAs[J]. Nature, 2012, 482(7385): 339-346.

18 Sugihara H, Ishimoto T, Miyake K, et al. Noncoding RNA expression aberration is associated with cancer progression and is a potential biomarker in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Int J Mol Sci, 2015, 16(11): 27824-27834.

19 Peng Z, Zhang C, Duan C. Functions and mechanisms of long noncoding RNAs in lung cancer[J]. Onco Targets Ther, 2016, 9: 4411-4424.

20 Hansen TB, Jensen TI, Clausen BH, et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges[J]. Nature, 2013, 495(7441): 384-388.

21 Thomas LF, Strom P. Circular RNAs are depleted of polymorphisms at microRNA binding sites[J]. Bioinformatics, 2014, 30(16): 2243-2246.

22 Li J, Yang J, Zhou P, et al. Circular RNAs in cancer: novel insights into origins, properties, functions and implications[J]. Am J Cancer Res, 2015, 5(2): 472-480.

23 Sand M, Bechara FG, Sand D, et al. Circular RNA expression in basal cell carcinoma[J]. Epigenomics, 2016, 8(5): 619-632.

24 Li F, Zhang L, Li W, et al. Circular RNA ITCH has inhibitory effect on ESCC by suppressing the Wnt/β-catenin pathway[J]. Oncotarget, 2015, 6(8): 6001-6013.

25 Wan L, Zhang L, Fan K, et al. Circular RNA-ITCH suppresses lung cancer proliferation via inhibiting the Wnt/β-Catenin pathway[J]. Biomed Res Int, 2016, 2016: 1579490.

26 Zeng XL, Zhang SY, Zheng JF, et al. Altered miR-143 and miR-150 expressions in peripheral blood mononuclear cells for diagnosis of non-small cell lung cancer[J]. Chin Med J, 2013, 126(23): 4510-4516.