IκB-ζ高表達在調控脂多糖誘導細胞炎癥反應中的作用

劉偉 張敏龍 薄麗艷 陳向軍 李艷燕 金發光

感染導致的急性肺損傷(acute lung injury, ALI)患病率逐年上升，一旦進展到急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)則病死率明顯升高[1-4]。如何逆轉ALI的“炎癥級聯反應”是目前的臨床難題[5]。IκB-ζ是由NfκBiz基因編碼的細胞核內非典型IκB家族蛋白[6]，在細胞核內能夠雙向調節NfκB活性[7]。但是在感染導致的ALI中IκB-ζ起到怎樣的炎癥調節作用，其調節炎癥反應的具體機制如何尚不清楚。本研究通過研究在細胞層面過表達的IκB-ζ蛋白在脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)干預的人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)中的作用，旨在明確IκB-ζ在LPS誘導的細胞炎癥反應中的具體作用及其具體機制，為感染導致的ALI的救治提供新的思路及理論基礎。

材料與方法

一、主要試劑及儀器

HUVECs細胞由第四軍醫大學病理生理學教研室惠贈，DMEM/F12培養液(Gibco,Cat.No. C11995500BT)，10%FBS(四季青)，OPTI-MEM(Gibco，Cat.No. 31985062)，IkBζ抗體(CST #9244)和IgG抗體(碧云天A7016)，NFkB P100/P52抗體(abcam ab175192)。Finnigan Surveyor高效液相系統，AB Sciex TripleTOF?6600質譜儀，Proteinsimple Wes儀器，ABI 7500定量PCR儀。

二、研究方法

1. 細胞培養: HUVECs細胞進行培養，培養條件：DMEM/F12(Gibco,Cat.No. C11995500BT)+10%FBS(四季青)，于 37 ℃，5% CO2，90%相對濕度培養箱進行培養，生長至對數期時進行傳代。

2. 免疫共沉淀

(1)細胞蛋白提取： 收細胞后，加入400 μl RIPA裂解液，在冰上孵育5 min；漩渦振蕩5 s， 12 000×g，4 ℃離心5 min；將上清液(6 mg/ml)轉入預冷的離心管中，置于冰上備用，取50 μl蛋白裂解液用于input，1 mg蛋白用于IgG組，1 mg蛋白用于IP組。

(2)免疫共沉淀： 取10 μl抗體原液，分別為IkBζ(cst#9244)抗體和IgG蛋白(碧云天A7016)，與1 mg蛋白的裂解液上清混合再用裂解緩沖液稀釋至900 μl，在4 ℃緩慢顛倒混勻過夜。取160 μl protein A/G瓊脂糖珠(GE Healthcare Life Sciences)，加200 μl裂解緩沖液洗滌3次， 4 ℃，3 000 g離心30 s留瓊脂糖珠子，加100 μl裂解緩沖液重懸，后進行捕獲免疫復合物及洗脫免疫復合物，洗脫后室溫下孵育10 min，沸水煮10 min，3 000×g離心30 s，取上清存于-80 ℃，或直接用于Western Blot分析。

(3)SDS-PAGE電泳與凝膠染色: 免疫復合物蛋白測濃度后，在體積分數為10%的SDS-PAGE進行電泳，電泳結束后，用考馬斯亮藍進行凝膠染色。

3. 質譜及數據庫分析IκB-ζ蛋白的互作蛋白

(1)蛋白酶解: 將IP及IgG兩個蛋白條帶分別切膠，進行脫色、還原、烷基化、酶解、脫水、酶切和肽段提取等處理。

(2)質譜檢測和數據庫分析: 肽段用樣品溶解液，通過Finnigan Surveyor高效液相系統讓多肽經過C18反向柱進行分離，分離后的肽段直接進入AB Sciex TripleTOF?6600質譜儀進行在線檢測。質譜原始文件經過M File Conversion軟件處理轉換，得到MGF格式文件，然后用MASCOT檢索NCBI Rattus數據庫和uniprot Rattus數據庫進行檢索，確定結合蛋白。IP組結合蛋白扣除IgG組結合的非特異蛋白即為特異性結合蛋白。

4. NfκBiz質粒合成: 選用pcDNA3.1作為載體，利用PCR的方法進行質粒合成。PCR引物序列如下： Humo- Nfkbiz -F: 5′ CGGGGTACCATGATTGTGGACAAGCTGC；3′Humo-Nfkbiz-R: 5′ GCCGAATTCCTAATACGGTGGAGCTCTCT 3′。以人CDNA為模板，擴增片段大小為2 175 bp，酶切位點分別為KpnI和EcoRI，前面的堿基為保護堿基。經過提取RNA，PCR，PCR產物純化，酶切，連接，轉化，擴增,挑單克隆等步驟，最終抽提質粒，進行測序后確定質粒制備成功。

5. 細胞轉染: 在轉染的前1 d，傳代準備細胞，按照每孔2×105個細胞接種到12孔板10個，2個作為空白組細胞，4個作為轉染空載組，4個作為轉染過表達，置于37 ℃、5% CO2培養箱培養，16 h～24 h后待細胞密度生長到60%時即可用于轉染。

取50 μl Opti-MEM稀釋在含有1.5 ml無血清培養液中，將空載體及Nfkbiz質粒以2 μg/μl濃度分別進行混合，室溫靜置20 min，然后將混合物分組逐滴均勻加入到對應培養皿中，輕微混勻。置于37 ℃，5% CO2培養箱中培養。4～8 h后換為正常細胞培養基。轉染細胞成功后各取2組需要加LPS，分別用LPS(1 μg/ml)干預無血清細胞12 h。48 h后分別做qPCR，Western blot等后續實驗。

6. Western blot 分析: 收集細胞后加入80 μl細胞裂解液冰上裂解10 min。以離心半徑8 cm，6 000 r/min，離心5 min，收集上清，測定蛋白濃度，制備蛋白樣品。Master mix與蛋白樣品1︰4的比例充分混勻，漩渦震蕩，然后將各個蛋白和Biotinylated Ladder分別插入漂板上進行沸水浴5～10 min。從試劑盒中將裝有預制膠的上樣板取出，緩慢撕開板上封口薄膜，進行樣品、各種試劑的上樣，打開Proteinsimple Wes儀器，將樣品板放入儀器，從試劑盒中取出毛細管安裝在儀器上。雙擊“compass”程序，單擊”Assay”。單擊“Start”，程序開始運行，等待實驗結果。

7. qPCR檢測: 按照RNA提取試劑說明書進行操作，TRNzol Universal。提取RNA后進行逆轉錄。按照qPCR反應體系進行上機檢測，每樣品每基因3個重復。設計qPCR引物如下：

IL1-F ATCAGCAAAGAAGTCAAGATGGC

IL1-R CATGGAGTGGGCCATAGCTT

IL6-F CCCACCGGGAACGAAAGAGA

IL6-R GCAGGCAACACCAGGAGCAG

TNF-α-F GCCTGCTGCACTTTGGAGTG

TNF-α-R TCGGGGTTCGAGAAGATGAT

三、統計學方法

結 果

一、免疫共沉淀所得蛋白質的SDS-PAGE分析

樣品經過免疫共沉淀，SDS-PAGE電泳并考馬斯亮藍染色后可見IκB-ζ抗體的IP組與IgG組相比有很多特異性條帶。將兩組切膠進行質譜分析，檢測IκB-ζ的特異性結合蛋白，見圖1。

圖1 用IκB-ζ抗體對正常HUEVCs細胞全蛋白進行免疫共沉淀的SD-PAGE考馬斯亮藍染色(IP條帶為IκB-ζ抗體的免疫沉淀產物，IgG為兔血清做的免疫沉淀產物作為對照)

二、蛋白質譜分析結果顯示IκB-ζ與幾個重要的蛋白結合

根據數據庫分析后挑選出IκB-ζ的結合蛋白TOP23，其中NfκB2(P52,P100)蛋白得分較高，與IκB-ζ互作作用較強，見圖2。

圖2 IκB-ζ的結合互作蛋白，基因NfκB2編碼的蛋白NfκB2(P52，P100)得分較高，與IκB-ζ互作作用較強

三、在LPS干預的HUVECs 細胞中過表達IκB-ζ與NfκB2(P52，P100)亞基結合并抑制其表達

NfκBiz質粒轉染HUVECs細胞，轉染后檢測IκB-ζ蛋白明顯高表達，證明NfκBiz質粒合成成功。NfκBiz質粒轉染HUVECs細胞后進行LPS干預無血清轉染細胞12 h，48 h后檢測IκB-ζ，NfκB P100及NfκB P52蛋白含量。結果顯示NfκBiz質粒轉染的HUVECs細胞進行LPS干預后，IκB-ζ蛋白較LPS組高表達，NfκB P100及NfκB P52較LPS組表達明顯降低，見圖3、4。

圖3 NfκBiz質粒轉染HUVECs細胞后IκB-ζ蛋白較對照組明顯高表達

圖4 NfκBiz質粒轉染的HUVECs細胞進行LPS干預后，IκB-ζ蛋白較LPS組高表達，NfκB P100及NfκB P52較LPS組表達明顯降低

圖5 NfκBiz質粒轉染的HUVECs細胞進行LPS干預后，IL-1，TNF-α較LPS組表達下調，IL-6較LPS組表達升高。*與對照組相比差異具有統計學意義(P<0.05)，**與LPS組相比差異具有統計學意義(P<0.05)

四、在LPS干預的HUVECs 細胞中IκB-ζ過表達能夠下調IL-1，TNF-α表達，同時上調IL-6表達

NfκBiz質粒轉染HUVECs細胞后進行LPS干預無血清轉染細胞12 h，48 h后檢測炎癥因子IL-1，IL-6及TNF-α的表達。結果顯示NfκBiz質粒轉染的HUVECs細胞進行LPS干預后，IL-1，TNF-α較LPS組表達下調，IL-6較LPS組表達升高，見圖5。

討 論

ALI是臨床較常見的急危重癥，易進展為ARDS，病死率大大升高[8]。感染是導致ALI的常見誘因，ALI的具體發病機制尚未明確[9]，但大多數學者認為其發病主要是由于各種原因特別是感染引起的全身炎癥反應失控，炎癥細胞浸潤，炎癥因子、自由基大量釋放，從而導致非特異性的肺泡-毛細血管上皮的廣泛損傷[10]。因此，如何控制細胞及肺組織的炎癥級聯反應是救治ALI的一大難題。

IκBζ蛋白屬于非典型IκB家族蛋白，最早IκBζ是在LPS刺激的巨噬細胞核內發現的，而在細胞漿中未測到該蛋白[11]。有研究表明在巨噬細胞中IκBζ對NF-κB有負反饋抑制作用，抑制IκBζ合成后炎癥反應也進一步加重[12-13]。但也有研究表明IκBζ的高表達可以促進炎癥反應，炎癥因子IL-6表達升高[14- 15]，因此，有學者認為IκBζ能夠雙向調節炎癥反應[7]。而本研究發現HUVECs系中LPS干預后IκBζ的高表達能夠降低IL-1，TNF-α表達，但同時IL-6表達升高，證明IκBζ確實能夠雙向調節細胞炎癥反應，不僅在巨噬細胞等炎癥細胞中，而且在血管內皮細胞中同樣能夠調節炎癥反應。

NF-κB蛋白家族在哺乳動物細胞中存在5個家族成員，包括P50(NF-κB1)、P52(NF-κB2)、RelA(p65)、RelB、c-Rel[16]。每個 NF-κB轉錄因子家族成員都可形成同源二聚體或與另一個家族成員形成異源二聚體，IκB家族的前體蛋白Pl00和P105與非活化的NF-κB以三聚體的形式存在于細胞中[17]。而IκB家族的前體蛋白Pl00 能夠經過泛素化磷酸化加工處理為P52，因此，也有學者將P100與P52合稱為NF-κB2蛋白[18]。IκBζ屬細胞核IκB蛋白，通過與 NF-κB的亞單位結合，達到抑制細胞核中炎癥相關基因的表達[19]。但是在血管內皮細胞的炎癥反應中，IκBζ到底是通過結合NF-κB哪個亞單位來調節炎癥反應尚不清楚[20-25]。本研究通過蛋白免疫共沉淀找到IκBζ的結合蛋白，再通過蛋白質譜分析找到了多個有意義的結合蛋白，其中發現NF-κB2(P52，P100)蛋白與IκBζ蛋白結合互作，最后又通過過表達IκBζ蛋白后發現P100和P52表達均降低，可能是與過表達的IκBζ蛋白結合的原故[26-30]。

因此，IκBζ可能是通過與Pl00和P52(NF-κB2)的二聚體或者三聚體結合來調節NF-κB的活性，降低IL-1，TNF-α表達，但同時IL-6表達升高，具有雙向調節炎癥反應的作用。

綜上所述，本研究明確了在HUVECs系中IκBζ高表達調節細胞炎癥反應的具體作用及機制，為進一步研究IκBζ在LPS導致的ALI中調節炎癥反應的機制奠定了基礎。

參 考 文 獻

1 薄麗艷, 李聰聰, 金發光. 抗氧化治療在急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征中的應用進展[J/CD]. 中華肺部疾病雜志(電子版), 2016, 9(1): 80-81.

2 吳秀琳, 李明霞, 蔡俊, 等. 轉錄激活因子3對綠膿桿菌致急性肺損傷小鼠肺泡灌洗液炎癥因子的影響[J/CD]. 中華肺部疾病雜志(電子版), 2016, 9(5): 484-488.

3 吳秀琳, 陳復輝, 錢斕蘭, 等. 活化轉錄因子3與急性肺損傷[J/CD]. 中華肺部疾病雜志(電子版), 2017, 10(2): 215-217.

4 Villar J, Sulemanji D, Kacmarek RM. The acute respiratory distress syndrome: incidence and mortality, has it changed?[J]. Curr Opin Crit Care, 2014, 20(1): 3-9.

5 Xu Z, Huang Y, Mao P, et al. Sepsis and ARDS: The Dark Side of Histones[J]. Mediators Inflamm, 2015, 2015: 205054.

6 Yamazaki S, Muta T, Takeshige K. A novel Ikappa B protein, Ikappa B-zeta, induced by proinflammatory stimuli, negatively regulates nuclear factor-kappa B in the nuclei[J]. J Biol Chem, 2001, 276(29): 27657-27662.

7 Motoyama M, Yamazaki S, Eto-Kimura A, et al. Positive and negative regulation of nuclear factor-kappa B-mediated transcription by Ikappa B-zeta, an inducible nuclear protein[J]. J Biol Chem, 2005, 280(9): 7444-7451.

8 Rezoagli E, Fumagalli R, Bellani G. Definition and epidemiology of acute respiratory distress syndrome[J]. Ann Transl Med, 2017, 5(14): 282.

9 Monahan LJ. Acute respiratory distress syndrome[J]. Curr Probl Pediatr Adolesc Health Care, 2013, 43(10): 278-284.

10 Filgueiras LJ, Martins JO, Serezani CH, et al. Sepsis-induced acute lung injury (ALI) is milder in diabetic rats and correlates with impaired NFkB activation[J]. PLoS One, 2012, 7(9): e44987.

11 Kim D, Kolch W, Cho KH. Multiple roles of the NF-kappa B signaling pathway regulated by coupled negative feedback circuits[J]. FASEB J, 2009, 23(9): 2796-2802.

12 Muta T. Ikappa B-zeta: an inducible regulator of nuclear factor-kappa B [J]. Vitam Horm, 2006, 74: 301-316.

13 Muta T, Yamazaki S, Eto A, et al. Ikappa B-zeta, a new anti-inflammatory nuclear protein induced by lipopolysaccharide, is a negative regulator for nuclear factor-kappa B[J]. J Endotoxin Res, 2003, 9(3): 187-191.

14 Seshadri S, Kannan Y, Mitra S, et al. MAIL regulates Human monocyte IL-6 production[J]. J Immunol, 2009, 183(8): 5358-5368.

15 Sundaram K, Rahman MA, Mitra S, et al. IkappaBzeta regulates Human monocyte pro-inflammatory responses induced byStreptococcuspneumoniae[J]. PLoS One, 2016, 11(9): e161931.

16 Rahman A, Fazal F. Blocking NF-kappa B: an inflammatory issue[J]. Proc Am Thorac Soc, 2011, 8(6): 497-503.

17 Mitchell S, Vargas J, Hoffmann A. Signaling via the NFkappaB system[J]. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med, 2016, 8(3): 227-241.

18 Busino L, Millman SE, Pagano M. SCF-mediated degradation of p100 (NF-kappaB2): mechanisms and relevance in multiple myeloma[J]. Sci Signal, 2012, 5(253): t14.

19 Brennenstuhl H, Armento A, Braczysnki AK, et al. Ikappa Bzeta, an atypical member of the inhibitor of nuclear factor kappa B family, is induced by gamma-irradiation in glioma cells, regulating cytokine secretion and associated with poor prognosis[J]. Int J Oncol, 2015, 47(5): 1971-1980.

20 Zhu J, Weinberg R, Wu X, et al. Ikappab-zeta plays an important role in the ERK-dependent dysregulation of malaria parasite GPI-induced IL-12 expression[J]. IUBMB Life, 2012, 64(2): 187-193.

21 Tartey S, Matsushita K, Vandenbon A, et al. Akirin2 is critical for inducing inflammatory genes by bridging IκB-ζ and the SWI/SNF complex[J]. EMBO J, 2014, 33(20): 2332-2348.

22 Nogai H, Wenzel SS, Hailfinger S, et al. IκB-ζ controls the constitutive NF-κB target gene network and survival of ABC DLBCL[J]. Blood, 2013, 122(13): 2242-2250.

23 Hanihara F, Takahashi Y, Okuma A, et al. Transcriptional and post-transcriptional regulation of IκB-ζ upon engagement of the BCR, TLRs and FcγR[J]. Int Immunol, 2013, 25(9): 531-544.

24 H?rber S, Hildebrand DG, Lieb WS, et al. The Atypical inhibitor of NF-κB, IκBζ, controls macrophage interleukin-10 expression[J]. J Biol Chem, 2016, 291(24): 12851-12861.

25 Hanihara-Tatsuzawa F, Miura H, Kobayashi S, et al. Control of Toll-like receptor-mediated T cell-independent type 1 antibody responses by the inducible nuclear protein IκB-ζ[J]. J Biol Chem, 2014, 289(45): 30925-30936.

26 Hildebrand DG, Alexander E, H?rber S, et al. IκBζ is a transcriptional key regulator of CCL2/MCP-1[J]. J Immunol, 2013, 190(9): 4812-4820.

27 Zhang L, Chen Y, Yue Z, et al. The p65 subunit of NF-κB involves in RIP140-mediated inflammatory and metabolic dysregulation in cardiomyocytes[J]. Arch Biochem Biophys, 2014, 554: 22-27.

28 Pietri JE, Pietri EJ, Potts R, et al. Plasmodium falciparum suppresses the host immune response by inducing the synthesis of insulin-like peptides (ILPs) in the mosquito Anopheles stephensi[J]. Dev Comp Immunol, 2015, 53(1): 134-144.

29 Yunoki T, Tabuchi Y, Hayashi A, et al. BAG3 protects against hyperthermic stress by modulating NF-κB and ERK activities in Human retinoblastoma cells[J]. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 2015, 253(3): 399-407.

30 Zhao Q, Du Q, Wei F, et al. An Infectious disease-associated Ⅱ12b polymorphism regulates IL-12/23 p40 transcription involving poly(ADP-ribose) polymerase 1[J]. J Immunol, 2017, 198(7): 2935-2942.