海洋紅酵母的酶法破壁及在發(fā)酵雞飼料中的應用

岳 春,姚 虹,李靖靖,初 峰

(1.南陽理工學院 生物與化學工程學院，河南 南陽 473004；2.鄭州工程技術學院 化工食品學院，鄭州 450044)

海洋紅酵母是自然海域中存在的一種酵母菌，其細胞中富含蛋白質、肝糖、不飽和脂肪酸、動物幼體生長激素及以蝦青素為主的類胡蘿卜素等多種營養(yǎng)物質。隨著水產養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展，海洋紅酵母已經被廣泛選用為海參、蝦、蟹、貝的幼體浮游期的鮮活餌料。[1]研究表明，海洋紅酵母能顯著提高幼苗的存活率、飼養(yǎng)效果和飼料報酬率，并能增強動物體的免疫功能，減少抗生素用量，是生態(tài)養(yǎng)殖的優(yōu)良添加劑。[2]目前國內的飼料主要以傳統(tǒng)的蛋白飼料為主，還停留在較低水平。近年來國內有廠家開始工業(yè)化試生產紅酵母飼料，國外已用于飼料添加劑中，[3-4]但類胡蘿素是紅酵母細胞內產物，破壁效果及提取方法直接影響紅酵母發(fā)酵生產類胡蘿素的產量、質量和生產成本。[5]因此，研究紅酵母破壁方法具有重要意義。

海洋紅酵母的破壁方法有很多，目前研究較多的是化學法，但化學法破壁條件苛刻，并有可能改變蝦青素的理化性質。酶法破壁近年才開始研究，條件溫和，能很好的避免蝦青素等多種營養(yǎng)物質被破壞，并有利于提取。溫和的化學滲透劑可以改變酵母細胞壁或膜的通透性，從而使內含物有選擇地滲透出來并保持活性不變。[6]

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

海洋紅酵母菌種：南陽理工學院實驗室保存；發(fā)酵雞飼料：實驗室自制；β-甘露聚糖酶：湖北佳諾信生物化工有限公司，酶活力為50000U/g；蛋白胨：博歐特(天津)化工貿易有限公司；酵母膏：河南三順教學儀器有限公司； 葡萄糖：北京鵬彩精細化工有限公司；硫酸鎂、氯化鈉、硫酸銅、硫酸鉀：上海埃彼化學試劑有限公司；磷酸氫二鉀、二甲基亞砜：德州市富凱化工有限責任公司；丙酮：南京化學試劑有限公司；濃硫酸、硼酸：天津賽孚瑞科技有限公司。

1.2 儀器與設備

BPX-82型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海科曉科學儀器有限公司；DK-98-1型恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；101-2A型電熱鼓風干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；PHS-3B 型精密pH計：上海雷諾儀器廠；BS 100 S型電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；YX-280A型高壓滅菌鍋：南京市科立華儀器儀表有限公司；TGL-20B型臺式離心機：上海沉黃科學儀器有限公司；HZQ-X100A型恒溫培養(yǎng)震蕩箱：南京曉曉儀器設備有限公司；WF2-2000型721分光光度計：上海龍尼柯儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基的制備

(1)斜面活化培養(yǎng)基：葡萄糖25.0g/L，蛋白陳8.0g/L，酵母粉5.0g/L，瓊脂20.0g/L，pH 5.0。

(2)液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖25.0g/L，蛋白陳8.0g/L，酵母粉5.0g/L，磷酸二氫鉀 5.6g/L，氯化鈉 10.0g/L，硫酸鎂3.0g/L，pH 4.8～5.0。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖25.0g/L，蛋白陳8.0g/L，酵母粉5.0g/L，磷酸二氫鉀5.6g/L，氯化鈉10.0g/L，硫酸鎂3.0g/L，pH 4.8～5.0。

pH由緩沖劑來調節(jié)，各種培養(yǎng)基經過121℃，30min滅菌后冷卻至常溫備用。

1.3.2 菌株的培養(yǎng)[7]

(1)菌株活化

將保藏于冰箱中的菌種接種在上述斜面培養(yǎng)基上，于30℃活化48h。

(2)種子培養(yǎng)

從斜面接2環(huán)到裝量為50mL/250 mL三角瓶中,于28℃,300r/min離心培養(yǎng)24h。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)

以10%接種量接入與種子培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基中,裝量50mL/250 mL,于30 ℃,300 r/min培養(yǎng)72h。

1.3.3 加酶破壁

稱取一定量β-甘露聚糖酶，將其溶于無菌水中配成溶液,將酶溶液加入發(fā)酵培養(yǎng)一定時間后的搖瓶中,然后在300r/min轉速下旋轉振蕩一定時間。[8]

1.3.4 分析測定方法

(1)蛋白質含量的測定：凱氏定氮法(測定飼料中蛋白質的含量)。

(2)類胡蘿卜素總量的測定：二甲基亞砜(DMSO)法[9]。

(3)破壁率的測定[10]：取4mL發(fā)酵液,離心后用去離子水洗滌離心3次,加10mL丙酮直接提取,4000r/min轉速下離心10 min,上清液在480nm處以丙酮為空白測定吸光度Aa。酵母破壁率計算式為：酵母破壁率=Aa/A×100%。

1.3.5 單因素試驗設計

考慮不同的加酶量、酶解時間、酶解溫度、pH對細胞破壁率的影響。

1.3.6 正交試驗設計

以破壁率為考察指標，采用L9(34)正交表進行三因素三水平正交試驗，根據單因素試驗的結果選擇酶解時間、酶解溫度、加酶量三個因素進行正交試驗,篩選出最佳的因素水平。正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表

1.4 應用[11-12]

(1)發(fā)酵飼料的準備：通過計算，稱取一定量的發(fā)酵飼料。

(2)添加破壁酵母：按照最優(yōu)條件對海洋紅酵母進行破壁，將破壁后的酵母按照一定比例添加于發(fā)酵飼料中，制成高蛋白、含類胡蘿卜素的飼料，并測定其中蛋白質和類胡蘿卜素的含量。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果及分析

2.1.1 加酶量對甘露聚糖酶酶解效果的影響

分別稱取0.01g，0.02g，0.03g，0.05g，0.07g的酶，依次裝入試管中加入等量的無菌水配制成溶液，然后分別加入到發(fā)酵培養(yǎng)72h的發(fā)酵液中，放入搖床中在50℃，300r/min條件下酶解5h，之后取出將三角瓶放置在沸水浴中滅酶活，測吸光度,計算破壁率。加酶量對海洋紅酵母破壁率的影響如圖1所示。

圖1 加酶量對破壁效果的影響

由圖1可以看出，隨著加酶量的增多，吸光度和破壁率也隨之提高，當加酶量大于0.05g之后，吸光度和破壁率增加的趨勢變小?？赡苁且驗榈孜餄舛纫欢?，酶解程度近乎達到完全，環(huán)境的改變也可能在一定程度上影響酶的作用，所以當酶量達到一定值后吸光度和破壁率不再隨之增加。故最佳酶量選擇0.05g為宜。

2.1.2 酶解時間對甘露聚糖酶酶解效果的影響

將海洋紅酵母發(fā)酵培養(yǎng)72h后，分別加入β-甘露聚糖酶0.05g，于300r/min，50℃條件下振蕩酶解2h，4h，5h，6h，8h后在沸水浴中進行滅酶活，測定發(fā)酵液的吸光度，計算破壁率，結果見表2和圖2。

表2 不同酶解時間下的測定結果

圖2 酶解時間對破壁效果的影響

由圖2可以看出，在β-甘露聚糖酶水解海洋紅酵母發(fā)酵液的過程中，隨著β-甘露聚糖酶水解時間的增加，吸光度和破壁率也隨之增加，當水解6h后含量繼續(xù)增加，但隨著時間的延長，增加趨勢變小，可能是因為酶的水解作用已達完全。因此，選擇6h左右為最佳酶解時間。

2.1.3 酶解溫度對甘露聚糖酶酶解效果的影響

將海洋紅酵母發(fā)酵培養(yǎng)72h后，加入β-甘露聚糖酶0.05g，分別于30℃，40℃，45℃，50℃，55℃和60℃水解6h，迅速取出放在沸水浴中滅酶活，經過離心，提取，測定上清液的吸光度，計算破壁率，結果見表3和圖3。

表3 不同酶解溫度下的測定結果

圖3 酶解溫度對破壁效果的影響

由圖3可以看出，50℃時海洋紅酵母的破壁率最高，可能是因為當溫度逐漸升高到50℃時，溫度逐漸接近酶的最適溫度，所以甘露聚糖酶的破壁率逐漸升高，但隨著溫度升高，由于酶慢慢失去活性，酶解效果減弱，故破壁率呈下降趨勢。因此，酶解溫度選擇50℃左右較適宜。

2.1.4 pH對破壁效果的影響

按照0.05g加酶量在50℃酶解溫度下，分別調整發(fā)酵液的pH，震蕩酶解6h。測定結果和酶解曲線分別見表4和圖4。

表4 不同pH下的測定結果

由圖4曲線可知，pH4～5時，破壁率隨pH的上升而增加，pH大于5時，細胞破壁率隨pH上升而下降，應該是因為pH接近5時逐漸接近甘露聚糖酶的最適pH，此時酶活力比較高，而當pH繼續(xù)增大，環(huán)境的改變使酶不再適應，酶活力也降低，所以破壁率隨pH增大而下降。因此，酶解pH取5左右為佳。

2.2 甘露聚糖酶酶解海洋紅酵母條件的優(yōu)化結果與分析

根據1.3.6的方法在單因素試驗的基礎上進行正交試驗設計[12]。

2.2.1 正交試驗結果與極差分析

采用L9(34)表設計試驗，試驗結果及極差分析見表5和圖5。

圖5 因素與指標趨勢圖

由表5可以看出，對于A因素而言，k1>k2>k3,由于破壁率是越大越好，所A1為A因素的最優(yōu)水平；對于B因素而言，k2>k1>k3，所以B2為B因素的最優(yōu)水平；對于C因素而言，k2>k3>k1,即C2為C因素的最優(yōu)水平。故本試驗的最優(yōu)水平組合為A1B2C2，即甘露聚糖酶酶解海洋紅酵母的最佳條件為加酶量0.05g，酶解溫度50℃，酶解時間6h。

表5 正交試驗結果

由極差分析以及因素與指標趨勢圖可以得出，RC>RB>RA，各因素對破壁率影響的主次順序為C>B>A，即加酶量的影響最大，其次是酶解溫度和酶解時間。

2.2.2 正交試驗設計方差分析

通過計算進行顯著性檢驗，列出方差分析表，結果由SPSS軟件得出，結果見表6。

表6 方差分析表

由表6可見，因素C最顯著，A和B均不顯著，各因素對試驗結果的影響主次順序為C>B>A。

2.2.3 正交試驗小結

通過對正交試驗結果的極差分析和方差分析，可見試驗結果一致。加酶量為主要的影響因素,不同的加酶量對海洋紅酵母細胞壁的破壁率影響最大,最合適的加酶量為0.05g；酶解溫度的變化對紅酵母破壁率的影響次之,以50℃為最好；酶解時間的變化對海洋紅酵母破壁率的影響最小,以6h為最佳。通過正交試驗的優(yōu)化組合,得到海洋紅酵母菌細胞酶法破壁的最優(yōu)條件:50mL海洋紅酵母培養(yǎng)液發(fā)酵培養(yǎng)72h，加酶量為0.05g，酶解溫度為50℃,酶解時間為5h，pH為5，搖床300r/min。在此優(yōu)化的培養(yǎng)條件下,海洋紅酵母的破壁率可達81.25%。

2.3 最優(yōu)條件在發(fā)酵飼料中的應用

根據以上正交試驗所得最佳海洋紅酵母破壁條件，將制備的50mL破壁海洋紅酵母培養(yǎng)液直接加入到50g飼料中混勻，然后將其烘干，測定蛋白質含量與類胡蘿卜素含量，結果見表7。

表7 測定結果

由表7可知，添加酵母后可明顯增加蛋白質含量，在一定程度上也增加了類胡蘿卜素的含量，試驗條件可行。

2.4 應用分析與討論

由以上試驗結果可知，在試驗條件下，的確能增加蛋白質和類胡蘿卜素含量，但是在實際應用時還應進一步驗證，主要有以下幾個問題：

(1)本試驗目的是提高紅酵母在飼料中的利用率，即破壞酵母細胞壁，使細胞內類胡蘿卜素釋放，最終增加畜禽產品的感官色澤與營養(yǎng)價值。關于本試驗的結論最終應用結果如何，添加多少能達到最好效果，還要在飼喂之后才能最終定論。

(2)試驗與實際應用的量之間還有很大的差別。試驗是短時的，實際應用中更要考慮飼料的成本問題，以及飼料本身的保藏問題。

(3)最終符合要求的飼料中的添加量，還需要在實際應用中探究。

(4)本試驗采用的是甘露聚糖酶酶解的方法，但是酵母細胞壁中含有少量蛋白，試驗中并未用到蛋白酶。考慮原因：其一，飼料本身原料中有豆粕，大豆蛋白比較多，蛋白酶的加入會使其水解，容易出現苦味，從而影響飼料本身的風味。雖然有一定的方法掩蓋苦味，但方法比較復雜，另外還需要進一步考慮成本問題。其二，加入蛋白酶雖然在一定程度上能提高氨基酸的含量，并且能提高消化率，但是氨基酸產品不容易保藏。

3 結論

本試驗以實驗室保藏海洋紅酵母為菌種，采用酶法對海洋紅酵母進行細胞破壁，通過對影響破壁條件的幾個因素(加酶量、酶解時間、酶解溫度、pH)的單因素研究，采用正交試驗得出較佳的酶解條件組合，并將其添加到發(fā)酵雞飼料中，通過分析測定蛋白質的含量，來確定破壁海洋紅酵母在飼料中的應用效果。具體結論如下：

(1)通過正交試驗得出最佳酶解條件：海洋紅酵母發(fā)酵培養(yǎng)72h，加酶量為0.05g，酶解溫度為50℃,酶解時間為6h，搖床300r/min。在此條件下,海洋紅酵母的破壁率可達81.25%。

(2)按照以上條件所制得的破壁酵母，將其加入到發(fā)酵飼料中，加入之前飼料蛋白含量為25%左右，加入之后蛋白含量為45%左右，比之前蛋白含量提高了20%。

(3)本方法不僅增加了飼料蛋白質含量，提高了飼料的營養(yǎng)價值，同時也增加了類胡蘿卜素的含量，測得類胡蘿卜素的含量為11.56μg/g。

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