大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)和分化能力鑒定*

★周年 劉波 徐彭（1.江西中醫(yī)藥大學藥學院 南昌 330004；2.江西省藥品檢驗檢測研究院 南昌 330029；3.江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心 南昌 330029；4.江西省中藥藥理學重點實驗室 南昌 330004）

骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是存在于骨髓的間充質(zhì)干細胞（MSCs），有自我復制、更新及多向分化潛能的成體多能干細胞，在不同的誘導條件下分化為成骨細胞、脂肪細胞等成熟的間質(zhì)細胞［1-3］，在骨病防治中有重要意義。目前主要采用全骨髓貼壁法、密度梯度離心法、細胞表面分子標記分選法和細胞篩選法等方法進行分離［4-5］，其中全骨髓貼壁法分離的細胞活性高，增殖能力強，但對于細胞骨向分化和脂向分化能力的明確評價并不清楚。因此，本研究主要采用全骨髓貼壁法獲取骨髓細胞P3代，考察其骨向分化和脂向分化能力，為骨病防治研究和組織工程研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠，3月齡，體重150g左右，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2013-0004，實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準，室溫控制在20℃～22℃，恒濕，光照與環(huán)境一致，實驗期間自由飲水，實驗前12h禁食。3-異丁基-1-甲基黃嘌呤購于Sigma公司；4-硝基苯磷酸二鈉購于成都西亞試劑公司；Anti-Mouse/Rat CD29 FITC（E17759103）、Anti-Rat CD45 FITC（E17627102）、Anti-Mo/RatCD90.1（Thy1.1） PE（E013771631）、Anti-Rat CD11b/c PE（E15919105）均購于eBioscience公司；β-甘油磷酸鈉、胰島素、地塞米松、L-抗壞血酸、油紅O、茜素紅等均購于北京索萊寶科技有限公司，并配制骨向分化誘導液（β-甘油磷酸鈉、地塞米松、L-抗壞血酸）和脂向分化誘導液（地塞米松、胰島素、吲哚美辛、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤）。

1.2 方法

1.2.1 全骨髓貼壁法分離骨髓細胞及傳代培養(yǎng) 3月齡SD雌性大鼠脫臼處死，75%酒精浸泡10min，無菌條件下分離后肢的雙側(cè)脛骨及股骨，剔除周邊的肌肉、肌腱及結(jié)締組織，剪去兩端的骨骺端，充分暴露骨髓腔，以5mL注射器吸取LG-DMEM培養(yǎng)液反復沖洗骨髓腔至變白。收集骨髓懸液置于10mL離心管，低速離心1000rpm×5min，棄上清，以3mL新鮮含15%胎牛血清的LG-DMEM完全培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度以1×106cells/mL進行接種，然后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，并置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。72h首次半量更換培養(yǎng)基，更換培養(yǎng)基前，輕輕振蕩培養(yǎng)瓶3～4次，充分使非貼壁細胞通過更換培養(yǎng)基而清除，以后每4d全量更換培養(yǎng)基1次，同樣采取輕度振蕩篩選細胞，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和生長情況，此時細胞即為骨髓P0代細胞，待細胞達到80%～90%融合，棄培養(yǎng)液，PBS清洗，以胰酶消化，進行傳代擴增，此時培養(yǎng)的細胞為骨髓P1代細胞，同樣方法，依次消化傳代并記作骨髓細胞P2～P3代等，最終取骨髓P3代細胞進行細胞鑒定，以確定其分化功能適合作為種子細胞。

1.2.2 大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學觀察 自原代培養(yǎng)開始通過顯微鏡下觀察大鼠骨髓細胞的形態(tài)。

1.2.2.2 骨髓細胞表面標志物的鑒定 取P3代大鼠骨髓細胞，以不含EDTA的胰酶消化后，制成單細胞懸液，并調(diào)整細胞數(shù)為106～107/mL，以直接免疫熒光法針對細胞表面抗原檢測細胞免疫表型，用胎牛血清配制的FACS緩沖液1500rpm×3min，重懸洗滌后，各管分別加入CD29、CD45、CD11b/c、CD90.1等標志物抗體及同型對照抗體，室溫避光孵育30min，PBS緩沖液洗滌離心3000rpm×3次，1%多聚甲醛固定，以流式細胞儀進行檢測。

1.2.2.3 骨髓細胞骨向分化能力鑒定 取生長狀態(tài)良好的P3代骨髓細胞，以1×105cells/mL密度接種于24孔板中，實驗分為兩組，即對照組和誘導組，每組6個復孔，對照組正常換液，誘導組則加入骨向分化誘導液，每3d換液1次，光鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

堿性磷酸酶染色：經(jīng)骨向分化誘導液誘導12 d后取出培養(yǎng)板，以PBS沖洗，95%乙醇固定細胞10min，以改良鈣鈷法制備，光鏡下觀察。

堿性磷酸酶活力檢測（ρNPP法）：經(jīng)骨向分化誘導液誘導12d后取出培養(yǎng)板，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，PBS洗2遍，每孔加入細胞裂解液300μL（0.1%Triton X-100），4℃作用30min，收集裂解液采用對硝基酚磷酸鹽法測定堿性磷酸酶濃度，以ρNPP為底物，根據(jù)水解磷酸酯鍵所產(chǎn)生的對硝基酚基測定酶活力。

礦化結(jié)節(jié)染色：取出誘導21d的培養(yǎng)板，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，PBS清洗，95%乙醇固定20min，以0.1%茜素紅染色，光鏡下觀察。

1.2.2.4 細胞脂向分化能力鑒定 取生長狀態(tài)良好的P3代骨髓細胞，調(diào)整細胞密度為1×105cells/mL接種24孔培養(yǎng)板上。實驗分為兩組，即對照組和誘導組，每組6個復孔，對照組正常換液，誘導組則加入脂向分化誘導液，每3d換液1次，光鏡下觀察細胞形態(tài)。

油紅O染色：誘導12d后取出孔板，PBS清洗，95%乙醇固定10min，PBS清洗1遍，60%異丙醇濕潤2min，吸出異丙醇后加入已過濾好的油紅O工作液染色15min；60%異丙醇分色至背景無色，光鏡下觀察。

油紅O染液半定量法：利用異丙醇充分溶解油紅O染液，520nm處檢測胞內(nèi)殘留染液的吸光度。

1.3 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)均用表示，SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行One-way ANOVA檢驗比較多組數(shù)據(jù)間差異顯著性，P＜0.05為差異具有顯著性，P＜0.01為差異具有極顯著性。

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨髓細胞的形態(tài)學觀察 原代培養(yǎng)時，全骨髓貼壁法分離的骨髓細胞呈圓形，胞體透亮，大小不一，與周圍的紅細胞等血系細胞相互混雜。72h半量換液后可見大量貼壁細胞，6～7d貼壁分裂細胞形成不同大小、分散的細胞集落，9～10d細胞逐漸融合成片，相互緊密貼附生長。細胞消化傳代至第3代，可見細胞呈均勻分布的紡錘形平均生長，呈典型的漩渦狀生長，見圖1。

圖1 細胞形態(tài)觀察（×100）

2.2 大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞表面標志物的鑒定 流式細胞法檢測發(fā)現(xiàn)，P3代細胞CD90、CD29陽性表達率分別為96.4%和78.5%，而CD45、CD11b/c陽性比率分別為2.0%和1.9%，見圖2。由于CD90和CD29為間充質(zhì)干細胞表面標志物，CD45、CD11b/c為造血系細胞表面標志物，結(jié)果表明，P3骨髓細胞絕大多數(shù)為大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞。

圖2 流式細胞儀鑒定P3骨髓間充質(zhì)干細胞

2.3 大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分化能力鑒定

2.3.1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞骨向分化能力鑒定 大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)骨向誘導后形態(tài)由原來的紡錘形逐漸轉(zhuǎn)化為多角形、方形等，較對照組細胞體積更大，細胞外基質(zhì)分泌逐漸增多，胞外可見許多黑色細小顆粒（見圖3）。骨向誘導12d后以改良鈣鈷法進行堿性磷酸酶染色，胞漿內(nèi)呈現(xiàn)深棕色或深黑色顆粒狀或大片狀黑色沉淀（見圖4），同時堿性磷酸酶活力明顯升高（P＜0.05，見圖5）；骨向誘導21d后運用茜素紅進行礦化結(jié)節(jié)染色，光鏡下誘導組可見細胞融合重疊生長，形成明顯的紅色致密結(jié)節(jié)，周圍呈放射狀突起，表明細胞形成礦化結(jié)節(jié)（見圖6）。

圖3 P3大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞骨向誘導形態(tài)觀察（×200）

圖4 P3大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞骨向誘導12d堿性磷酸酶染色（×100）

圖5 大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞骨向誘導堿性磷酸酶活力

圖6 大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞骨向誘導礦化結(jié)節(jié)染色（×100）

2.3.2 大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞脂向分化能力鑒定 骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)脂向誘導后形態(tài)逐漸由梭形變?yōu)閳A形、多角形等，誘導前期可見折光性強的圓形小脂滴，后期小脂滴逐漸增多融合成大脂滴，并將細胞核擠于一側(cè)，脂向誘導12d后用油紅O染色顯示脂滴呈紅色（見圖7），同時利用異丙醇充分溶解油紅O染液的原理，對殘留染液進行了半定量檢測。脂向誘導組較對照組明顯升高OD值，具有極顯著性差異（P＜0.01，見圖8）。

圖7 大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞脂向誘導倒置顯微鏡下觀察（×200）

圖8 大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞脂向分化脂質(zhì)累積值

3 討論

MSCs是一種起源于中胚層，在體外不同的誘導條件下分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞等成熟的間質(zhì)細胞，在骨髓最為常見，研究得最深入，目前主要采用全骨髓貼壁法進行分離培養(yǎng)［6-8］。但對于分離的骨髓細胞目前并沒有單一的特異性的方法來鑒定BMSCs。本研究采用全骨髓貼壁法進行分離培養(yǎng)骨髓細胞，傳代過程中充分利用細胞輕度振蕩來清除不貼壁細胞，提高細胞純度。研究發(fā)現(xiàn)細胞傳至第3代，細胞在顯微鏡下可見紡錘形生長，呈典型漩渦狀。流式細胞儀檢測細胞表面標志物的表達，發(fā)現(xiàn)CD90與CD29的陽性細胞比率分別為96.4%和78.5%；CD45和CD11b/c的陽性細胞比率分別為2.0%和1.9%，與文獻報道一致［9-11］，同時加入經(jīng)典骨向誘導劑和脂向誘導劑，發(fā)現(xiàn)細胞外基質(zhì)分泌增多，較對照組細胞胞漿內(nèi)可見明顯的深棕色或大片狀黑色沉淀，顯著升高ALP活力，且可見明顯的紅色致密結(jié)節(jié)，周圍呈放射狀突起，表明細胞聚集生長，逐漸形成礦化結(jié)節(jié)，充分表明BMSCs成功分化成了成骨細胞。在脂向誘導劑組初期可見折光性強的圓形小脂滴，經(jīng)油紅O染色后，誘導組可見被染成紅色的脂滴，采用異丙醇溶解油紅O染液半定量檢測，顯示脂向誘導組OD值明顯升高，進一步確定MSCs成功分化為脂肪細胞。這些結(jié)果一定程度上與國際社會公認的骨髓間充質(zhì)干細胞依據(jù)相符，即細胞的貼附特性、細胞標志物CD90，CD45等的表達和能否分化為成骨細胞和脂肪細胞等。

綜合形態(tài)學、細胞表面標志物及骨向分化和脂向分化誘導BMSCs結(jié)果，顯示全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)骨髓細胞，充分利用細胞輕度振蕩，培養(yǎng)至P3代的BMSCs具有骨向分化和脂向分化能力，可用于骨病防治研究和骨組織工程研究。

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