銀黃滴丸制劑提取物抗口腔潰瘍的藥效學研究

★劉新輝 孔小強 胡鵬翼 趙準 沈漢福 吳建明 劉秀娟 廖正根 朱金華 高書亮 余日躍,3**（.江西中醫藥大學 南昌 330004；.浙江維康藥業股份有限公司 浙江 麗水33000；3.江西省中藥藥理學重點實驗室 南昌 330004）

口腔潰瘍（oral ulcer）是口腔黏膜病中最常見的疾病，患病率高達20%左右，居口腔粘膜病的首位。主要表現為口腔粘膜反復出現孤立的、圓形或橢圓形的潰瘍，潰瘍表淺，呈淡黃色，或白色，邊緣整齊，周圍繞以紅暈，可單發或多發，有明顯的灼痛。發病不受年齡限制，以青年為多，女性略多于男性，一年四季均能發生，冬春季較多。動物模型的建立是研究疾病病因、機制及治療等的重要手段，國內外對口腔潰瘍動物模型的建立做了大量的研究和論證［1］。口腔潰瘍模型的建立方法多樣，本實驗采用細菌感染誘導法和化學物質灼燒法。

1 材料

1.1 動物 日本大耳兔（南昌龍平兔業有限公司，許可證號scxk（贛）2014-0005），雌雄兼用，體重2kg左右。

1.2 設備 包埋機（EG1150，徠卡公司）；切片機（RM2235，徠卡公司）；倒置熒光顯微鏡（IBE2000，徠卡公司）；內窺鏡等。

1.3 試藥與試劑 銀黃滴丸制劑前提取的金銀花提取物和黃芩提取物（浙江維康藥業股份有限公司提供，批號：B160505）。梔子金花丸（天津中新藥業集團股份有限公司樂仁堂制藥，批號：C145065）。金黃色葡萄球菌ATCC25923（江西省臨床檢驗中心）、苯酚溶液。

2 方法

2.1 藥液配制

2.1.1 供試液 銀黃滴丸制劑提取物（金銀花∶黃芩=5∶2）成人臨床劑量為24mg/kg，按體表面積折算家兔劑量為78.4mg/kg。擬設家兔的低、中、高劑量分別為78.4、156.8和313.6mg/kg。梔子金花丸為陽性藥，家兔劑量為420.43mg/kg。各藥液均用蒸溜水配成10mL/kg的混懸液，常溫保存，用前搖勻。

2.1.2 金黃色葡萄球菌溶液 取得金黃色葡萄球初始濃度為8.17×108cfu/mL，加生理鹽水稀釋至2.17×103cfu/mL，4℃冰箱儲存，備用。

2.2 口腔潰瘍的制備

2.2.1 感染性口腔潰瘍 取家兔48只，體重為2～3kg，雌雄各半，取40只家兔在其下牙床后部用鑷子造成黏膜20mm2左右的創傷，再用滴管滴一滴濃度為2.17×103cfu/mL的金黃色葡萄球菌溶液于創面，每日用沾有金黃色葡萄球菌溶液的鑷子刺激創面一次，連續3天，創面出現潰瘍面（白色或淡黃色假膜覆蓋）［2］，并用內窺鏡拍照，記錄潰瘍面大小。其余8只家兔為空白對照。

2.2.2 化學物質灼傷口腔潰瘍 另取家兔36只，體重為2～3kg，雌雄各半，從中取30只家兔造模，將一小棉球置于直徑為5mm的玻璃管一端（使之與管口平齊），再將玻璃管塞棉球一端蘸900g/L苯酚溶液，灼燒家兔左側面頰60s，24h后觀察，家兔口腔黏膜上均出現直徑5mm的潰瘍面［3］。內窺鏡拍照，記錄潰瘍面大小。其余6只家兔為空白對照。

2.3 給藥與觀察 40只感染性口腔潰瘍家兔，隨機分為5組，分別為陽性藥組、低劑量組、中劑量組、高劑量組和模型組。另8只未造模為空白組。每組家兔按相應劑量灌胃，給藥體積為10mL/kg，每天給藥一次，連續3天，模型組和空白組給相應的蒸溜水。30只苯酚灼傷口腔潰瘍家兔，隨機均勻分為5組，分別為陽性藥組、低劑量組、中劑量組、高劑量組和模型組。另6只未造模為空白組。給藥方法同2.3，連續給藥6天。家兔給藥前拍照其潰瘍面，記錄其大小。治愈率%=（給藥前面積-給藥后面積/給面藥前面積）%。

2.4 病理觀察 給藥末次24h后處死家兔，剪取家兔潰瘍組織，生理鹽水洗凈組織，空白組同理操作。并分裝放入10%的中性甲醛中固定48h左右，分組，編號。組織進行脫水、浸蠟、包埋，以4μm厚度組織橫斷面切片，常規HE染色，組織封片，倒置熒光顯微鏡拍照觀察，記錄結果。

2.5 統計學方法 實驗數據采用SPSS20.0軟件處理，數據均以均數±標準差表示，采用單因素方差分析比較組間差異，P＜0.05有統計學差異。

3 結果

3.1 銀黃滴制劑提取物對家兔口腔潰瘍假膜的治療作用 對內窺鏡照片進行肉眼觀察，給藥前，各組家兔均在口腔破潰處有一塊面積較大的白色或淡黃色的假膜，說明口腔潰瘍形成并非常明顯；與給藥第3天或第6天比較，除模型組外，其余各組家兔給藥后口腔潰瘍均出現一定的愈合，呈現顯著的藥效，而模型組有輕微的愈合。

3.2 銀黃滴丸制劑提取物對家兔口腔潰瘍面積的愈合作用 通過PS軟件對上述2.5內窺鏡照片進行治愈面積計算，從造模成功后開始拍照記錄到給藥結束，治療過程中潰瘍恢復的程度，即為治愈率。分別計算金黃色葡萄球菌所致的口腔潰瘍治治愈率和化學物質灼傷所致的口腔潰瘍治治愈率，結果見表1和表2。

表1 銀黃滴丸制劑提取物對金黃色葡萄球菌所致的口腔潰瘍治愈率（，n=8）

表1 銀黃滴丸制劑提取物對金黃色葡萄球菌所致的口腔潰瘍治愈率（，n=8）

注：與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 給藥前面積/mm2給藥后面積/mm2 治愈率/%空白組 0.00±0.00 0.00±0.00** 0.00±0.00**模型組 19.58 ±2.67 13.44 ±2.9 31.16 ±13.18陽性藥組 19.44 ±6.84 2.52 ±0.79** 84.53±7.53**低劑量組 19.56 ±8.45 8.19 ±2.62* 31.16 ±13.18*中劑量組 19.54 ±9.73 6.97 ±5.52** 67.98±21.38**高劑量組 20.17 ±22.00 5.37 ±3.85** 77.13±19.46**

表2 銀黃滴丸制劑提取物對化學物質灼傷所致的口腔潰瘍治愈率（，n=6）

表2 銀黃滴丸制劑提取物對化學物質灼傷所致的口腔潰瘍治愈率（，n=6）

注：與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 給藥前面積/mm2給藥后面積/mm2 治愈率/%空白組 0.00±0.00 0.00±0.00** 0.00±0.00**模型組 7.53±1.05 5.80±1.43 31.16 ±13.18陽性藥組 7.39±1.04 3.62±1.14* 84.53±7.53**低劑量組 7.68±1.55 4.01±0.93* 31.16 ±13.18*中劑量組 7.43±1.56 2.96±0.93** 67.98±21.38**高劑量組 7.45±1.89 3.40±1.56* 77.13±19.46**

3.3 組織病理學

3.3.1 銀黃滴丸制劑提取物對金黃色葡萄球菌所致家兔口腔潰瘍病理學影響 顯微鏡下放大10倍物鏡，觀察各組家兔潰瘍組織病理變化。結果表明，模型組上皮組織結構不清晰，有變性、壞死、缺失，粘膜表面有炎性分泌物，并有血痂形成，粘膜下局部有充血、水腫及炎性細胞浸潤。與模型組比較，陽性藥組個別家兔局部皮下有充血現象；空白組無明顯病理性改變；低、中、高劑量組上皮有局部變性、壞死，粘膜下局部有充血、炎性細胞浸潤。結果見圖1。

3.3.2 銀黃滴丸制劑提取物對化學物質灼傷所致家兔口腔潰瘍病理學影響 顯微鏡下放大10倍物鏡，觀察各組家兔潰瘍組織病理變化。結果表明，模型組粘膜層損傷明顯，上皮細胞脫落缺損，局部有細胞變性、壞死等病理性改變，粘膜及粘膜下可見充血、炎性細胞浸潤。與模型組比較，陽性藥組病理性損傷明顯減輕，上皮組織無明顯壞死；空白組組織結構正常，粘膜層完整無損；低、中、高劑量組病理性損傷減輕，上皮組織可見局部變性、壞死，局部粘膜下有充血及炎性細胞浸潤。結果見圖2。

圖1 銀黃滴丸制劑提取物對金黃色葡萄球菌所致家兔口腔潰瘍病理學影響

圖2 銀黃滴丸制劑提取物對化學物質灼傷所致家兔口腔潰瘍病理學影響

4 討論

口腔潰瘍（oral ulcers）俗稱“口瘡”，常見的發生于口腔黏膜的潰瘍性損傷病癥，多見于唇內側、頰黏膜、前庭溝、軟腭等部位，這些部位的黏膜缺乏角質化層或角化較差，從而易引起口腔潰瘍［3］。

銀黃滴丸制劑提取物的主要成分為金銀花和黃芩。金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或帶初開的花。夏初花開放前采收，干燥。具有清熱解毒，疏散風熱功能。主治癰腫疔瘡，喉痹，丹毒，熱毒血痢，風熱感冒，溫病發熱［4］。趙良忠等［5］研究表明，金銀花提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌、青霉、黃曲霉、黑曲霉有一定的一致作用，并研究表明，加熱處理可強化金銀花提取物的抑菌效果，確定了最佳工藝條件，金銀花提取物抑菌作用更為明顯。Lee等［6］證實了金銀花中的兩個單體化合物Loniceroside A和Lonicerin具有顯著的抗炎止痛作用。

黃芩為唇形科植物黃芩Scutellariabaicalensis Georgi的干燥根。春、秋二季采挖，除去須根和泥沙，曬后撞去粗皮，曬干。具有清熱燥濕，瀉火解毒，止血，安胎功能，主治血熱吐衄，癰腫瘡毒等［7］。Li等［8］將黃芩應用于體外抗菌試驗，結果表明，黃芩對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌等多種細菌均有一定的抑制作用。李倩楠等［9］研究表明，黃芩苷對發熱大鼠具有解熱作用，觀察藥后各組體溫變化率與IL-6、IL-1、βTNF-α含量變化率作相關性分析，結果表明黃芩苷有顯著的解熱作用，七解熱機制與TNF-α和IL-1β的含量減少密切的有關。

因此本實驗結合金銀花和黃芩的藥理作用對兩者聯合用藥，實驗表明，銀黃滴丸制劑提取物對金黃色葡萄球菌所致家兔口腔潰瘍有明顯的治療作用。另一部分，雖兩藥在化學物質灼傷所致家兔口腔潰瘍方面報道甚少，但通過實驗表明，銀黃滴丸制劑提取物對化學物質灼傷所致家兔口腔潰瘍也有明顯的治療作用。而在機制作用方面，根據Xiao Y等研究表明，Jinkoubao能大大改善家兔口腔癥狀并兔并促進其愈合，作者認為這可能是通過調節表皮生長因子水平，加強口腔潰瘍的修復能力［10］。本實驗僅銀黃滴丸制劑提取物對家兔進行形態學研究和藥效學研究，其在機制方面的作用有待進一步探究。

參考文獻

［1］Seko K, Kagami H, Senga K, et al. Effects of ovariectomy and estrogen replacement on rat oral mucosa [J]. Maturitas, 2005, 50(1):44-51.

［2］田景振,王靜.冰硼貼片的藥理作用及對動物口腔正常粘膜影響的研究[J]. 山東中醫藥大學學報, 1995(2):79-80．

［3］朱萱萱,王廣基,劉建平,等.口腔膜治療實驗性大鼠口腔潰瘍作用機理研究[J]. 中華中醫藥學刊, 2003, 21(1):84-85.

［4］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典·一部[S].北京:中國醫藥科技出版社, 2015:221．

［5］趙良忠,蔣賢育,段林東,等. 金銀花水溶性抗菌物質的提取及其抑菌效果研究[J]. 中國生物制品學雜志, 2006, 19(2):201-203.

［6］Lee SJ. Anitrinflammatoryactivity of the major constituents of Lonicerajaponical [J]. Arch Pharm Res, 1995, 18(2):133-135.

［7］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典·一部[S].北京:中國醫藥科技出版社, 2010:283.

［8］Li Y C, Shen J D, Li J, et al. Chronic treatment with baicalin prevents the chronic mild stress-induced depressive-like behavior: involving the inhibition of cyclooxygenase-2 in rat brain [J]. Progress in Neuropsychopharmacology& Biological Psychiatry, 2013, 40(2):138-143.

［9］李倩楠,葛曉群.黃芩苷的解熱作用及對細胞因子的影響[J]. 中國中藥雜志, 2010, 35(8):1 068-1 072.

［10］Xiao Y, Chen Q, Su S, et al. Effect of Jinkoubao on rabbit oral ulcer model [J]. Chongqing Medicine, 2017, 46(7):886-888.