兩種不同方法建立乳鼠神經細胞缺氧/復氧損傷模型

劉 威 王 爽 溫 娜 王洪羽 萬曉明 金 宏

(吉林醫藥學院臨床技能實驗室，吉林 吉林 132001)

目前缺血缺氧性腦病基本治療原則是恢復血流再通，常用的治療方法有溶栓、介入等〔1〕。但缺氧的腦組織在恢復血流灌注的同時卻往往損傷程度加重，形成缺氧/復氧損傷，這是臨床上最常見的腦血管疾病的病理過程之一，可導致神經細胞的直接或間接死亡，對患者預后產生不良影響，使其生活質量下降。目前利用藥物減輕氧化應激反應的研究成為熱點，建立簡便、穩定的神經細胞缺氧/復氧損傷模型是開展藥物研究的前提。本實驗采用兩種常見的導致細胞氧化損傷藥物：過氧化氫(H2O2)和氯化鈷(CoCl2)，分別作用于乳鼠原代提取神經細胞，分析其在建立缺氧/復氧損傷模型方面的應用價值。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 DMEMF12培養液為美國Gibco公司產品；MTT、胰蛋白酶為美國Sigma公司產品；新生牛血清為四季青公司產品；二氧化碳培養箱購自日本SANYO公司。

1.2細胞培養 取新生72 h內的SD大鼠乳鼠3～4只，剪取腦組織，冰面上平皿中磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，置于大離心管中剪碎，PBS液沖洗2次，以0.25%胰蛋白酶反復消化，直至組織塊消失。收集液以200目濾網過濾，離心重懸后調整密度為105～106ml-1接種于細胞培養板中，96孔板每孔200 μl。

1.3實驗分組及濃度處理 待細胞貼壁生長良好時分組，空白組無處理因素繼續培養，H2O2組加入H2O2終濃度為200、400、600、800、1 000 μmol/L的培養基，分別培養50 min、2 h、3 h后換正常培養基繼續培養18 h，不同濃度不同時間設3個復孔。CoCl2組分別加入CoCl2終濃度為100、200、300、400、500 μmol/L的無血清培養基，每個濃度設5個復孔，培養20 h后換正常培養液繼續培養24 h。

1.4MTT法檢測細胞存活率 培養結束后各組神經細胞以PBS清洗2次，加入無血清培養液及20 μl MTT溶液，37℃培養4 h。棄上清后每孔加入150 μl二甲基亞砜，震板10 min，酶標儀490 nm處測定吸光度(A)值，計算細胞存活率。

1.5統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件進行方差分析和配對t檢驗。

2 結 果

2.1H2O2致大鼠乳鼠神經細胞缺氧/復氧損傷結果 H2O2引起神經細胞缺氧/復氧損傷程度與劑量和時間呈正比，劑量越大，處理時間越長，細胞的損傷越明顯，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。其中600、800 μmol/L作用于神經細胞缺氧3 h，復氧24 h效果較好，細胞存活率在50%～60%，宜選擇該濃度和時間建立缺氧/復氧損傷模型。

表1 不同濃度H2O2作用不同時間對神經細胞存活率的影響

與空白組比較：1)P<0.05

2.2不同濃度CoCl2致大鼠乳鼠神經細胞缺氧復氧損傷結果 不同濃度 CoCl2作用于神經細胞24 h可導致細胞存活率明顯下降，與空白組〔(100.00±0.00)%〕相比差異有統計學意義(P<0.05)，其損傷程度隨CoCl2濃度增加而增強，100、200、300、400、500 μmol/L時，細胞存活率分別為(84.56±3.17)%、(80.29±41.02)%、(59.78±2.69)%、(51.59±3.06)%、(34.66±2.32)%,其中300、400 μmol/L作用24 h效果較好，可選擇該濃度造模。

3 討 論

缺血缺氧性腦病是臨床上常見的一種疾病，各種腦血管意外是其常見病因，減輕治療過程中產生的缺血再灌注損傷成為近年來成為研究的熱點。目前研究多采用體外培養細胞作為實驗對象，利用物理或化學方法建立缺氧損傷模型。物理方法多是利用含有氮氣的三氣培養箱，或利用氮氣密封體外培養細胞，造價昂貴，操作復雜，效果不穩定。相比之下利用化學藥物誘導細胞缺氧簡便易行，重現性好。本研究采用了兩種常用的氧化劑H2O2和 CoCl2作用于乳鼠神經細胞引起細胞氧化損傷。細胞的氧化損傷主要是由反應活性氧(ROS)引起的，它介導的氧化應激損傷與各種心腦血管疾病的發生和發展有關〔2〕。ROS種類多樣，H2O2是其中一種主要形式，它易于穿過細胞膜，在短期內引發細胞產生各種ROS；ROS在細胞內積聚，迅速引起細胞內物質過氧化，細胞功能紊亂，膜通透性增加甚至死亡〔3〕。本研究表明H2O2對細胞作用迅速，誘導缺氧效果顯著，該效果在一定范圍內與濃度呈正比。與H2O2相CoCl2作用神經細胞后往往引起缺氧過程較緩慢，有研究表明〔4〕利用CoCl2建立的鼠腦缺氧模型可用于研究細胞內相關酶，蛋白及細胞因子在缺氧損傷過程中的作用機制，其機制主要是Co2+可進入細胞并置換催化酶上的Fe2+導致酶失效〔5〕。另外也可使抑制引起細胞缺氧損傷的缺氧誘導因子(HIF)-1降解，從而誘發細胞缺氧損傷〔6〕。這些研究表明Co2+在造模機制上更符合慢性缺氧的特點，不僅僅可以成功模擬缺氧狀態，還可以模擬缺氧的病理過程。本研究表明CoCl2可誘導原代提取神經細胞的缺氧損傷，其嚴重程度與濃度在一定范圍內呈正比?？傊琀2O2和CoCl2這兩種氧化劑均可導致細胞氧化損傷，效果確切，且實驗模型易于建立，重復性好，但誘導細胞缺氧時間不同，可根據實驗要求選擇其中一種造模，以研究藥物對缺氧性疾病的作用機制。

1Roger VL,Go AS,Llo YD JM,etal.Heart disease and stroke statistics-2011 update:a report from the American Heart Association〔J〕.Circulation,2011;123(4):e18-e29.

2Nourazarian AR,Kangari P,Salmaninejad A.Roles oxidative stress in the development and progression of breast cancer〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev,2014;15(12):4745-51.

3陳剛領,鄭建普,李亞娟.H2O2氧化損傷血管內皮模型的構建及超氧化物歧化酶對損傷的逆轉作用〔J〕.中國藥理學通報,2009;25(7):884-7.

4Rani A,Prasad S.CoCl2induced biochemical hypoxia down regulates activities and expression of super oxide dismutase and catalase in cerebral cortex of mice〔J〕.Neurochem Res,2014;39:1787-96.

5Ohtomo S,Nangaku M,Lzuhara Y,etal.Cobalt ameliorates renal injury in an obese hypertensive type 2 diabetes rat model〔J〕.Nephrol Dial Transplant,2008;23(4):1166-72.

6Gilkes DM，Semenza GL,Wirtz D.Hypoxia and the extracellular matrix:drivers of tumour metastasis〔J〕.Nat Rev Cancer,2014;14(6):430-9.