TGIF2對高糖誘導的血管內皮細胞生物學行為的影響

何淑珍 黃 磊 阮 丹

(武漢市武昌醫院(三級醫院)老年病科，湖北 武漢 430063)

血管并發癥是引起糖尿病患者致殘和致死的重要因素，而導致血管損傷的原因與血管內皮細胞的生物學功能障礙關系密切。因此，改善血管損傷是治療糖尿病血管并發癥的重要手段。同源異型結構域蛋白轉化生長影響因子(TGIF)家族是屬于三氨基酸環延伸(TALE)超級家族成員，在腫瘤、代謝和組織分化等多種方面發揮重要的調控作用〔1～3〕。TGIF2是TGIF家族中的重要成員，有研究發現，TGIF2在糖尿病胰島β細胞的分化和形成中發揮促進作用〔4〕。然而，在高糖誘導的血管損傷中，目前并未發現TGIF2是否參與調控。本研究通過觀察TGIF2在高糖誘導下血管內皮細胞中的表達，以脂質體轉染上調其表達，觀察其對血管內皮細胞增殖、遷移和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1細胞與試劑 psiCHECK2-TGIF2 3′-UTR質粒和空載體陰性對照質粒(NC)購于上海派森諾公司。人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)購于美國ATCG公司，DMEM培養基購于GIBCO公司，熒光標記的羊抗兔IgG抗體、β-actin抗體和TGIF2抗體購于北京中杉金橋公司，胎牛血清、Lipofectmine2000和3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)試劑購于美國Sigma公司。RNA提取試劑盒和反轉錄試劑盒購于大連寶公司。聚偏氟乙烯(PVDF)膜、Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒和細胞裂解液購于上海碧云天公司，流式細胞儀和酶標儀分別購于美國BD公司和普利萊公司。PCR儀和電泳儀購于美國Bio-Rad公司，倒置顯微鏡購于日本Olympus公司，Transwell小室購于美國Corning公司，紫外分光光度儀購于上海第H儀器廠。

1.2細胞培養、分組和轉染 在溫度為37℃、CO2體積分數為5%環境下，以含10%胎牛血清的DMEM培養基進行培養，待HUVECs細胞融合度達到80%左右時，胰酶消化，傳代。取24孔細胞板，以每孔30 000個細胞接種。收集生長狀態良好的HUVECs細胞進行實驗。將細胞隨機分為4組，對照組：不做處理；高糖組：25 mmol/L D-葡萄糖干預；NC高糖組：先轉染NC，再加入25 mmol/L D-葡萄糖進行干預；TGIF2高糖組：先轉染psiCHECK2-TGIF2 3′-UTR質粒，再加入25 mmol/L D-葡萄糖進行干預。參照Lipofectmine2000使用說明將2.5 μl終濃度均為30 nm的psiCHECK2-TGIF2 3′-UTR質粒/NC、10 μl Lipofectmine2000和200 μl無血清培養基轉染至siRNA TGIF2高糖組/NC高糖組細胞中，轉染24 h后，加入D-葡萄糖處理48 h后，收集各組細胞進行后續實驗。

1.3RT-PCR檢測 采用Trizol法提取各組HUVECs細胞的總RNA，并采用紫外分光光度計定量其濃度。經逆轉錄試劑盒合成cDNA。將配制好的20 μl反應體系上PCR儀擴增。其中，每組設3個平行孔。β-actin上游引物：5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，下游：5′-GCTGTCACCTTCACCCTTCC-3′；TGIF2上游引物：5′-GGCACCTAGCAGAGAAA-GATAAG-3′，下游：5′-GGGAGGCTGAGGCAAATAAT-3′。反應條件：94℃預變性240 s，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸120 s，上述過程重復35次。以內參β-actin校正，2-△△Ct法計算TGIF2 mRNA相對表達水平。

1.4Western印跡檢測 向4組細胞中加入細胞裂解液，提取各組細胞的總蛋白，并以二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒對其定量。將所提取的總蛋白以沸水浴變性5 min后，取60 μg上樣至10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中分離，每組設置3個復孔。開始以80 V電泳，至分離膠后改為120 V。待結束后，以半干法轉印。再將轉印后的PVDF膜置于含有5%脫脂奶粉的封閉液中。反應2.5 h后，加入1 000倍稀釋的TGIF2抗體和β-actin抗體，4℃下過夜。次日，經Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗滌后，加入2 500倍稀釋的二抗，反應1 h。洗膜后，加顯色液電化學發光(ECL)顯影。以β-actin作內參，Image J軟件分析各組HUVECs細胞中TGIF2蛋白的相對表達量。

1.5細胞增殖實驗 取96孔細胞板，以每孔55 000個細胞接種，以10%胎牛血清的DMEM培養基常規培養。實驗分組及處理同1.2，每組設5個平行孔，每組重復3次。處理完畢后，在孵箱中培養24 h和48 h后，取出培養板。每孔加入20 μl濃度為5 mg/ml MTT溶液，培養4 h后棄上清，加150 μl二甲基亞砜。待充分反應后，以酶標儀檢測各組HUVECs細胞在570 nm處的吸光度(OD)值。

1.6細胞遷移實驗 以無血清的DMEM培養基懸浮4組細胞，制備濃度為50 000個/ml的細胞懸液。取Transwell小室(孔徑8 μm)，上室中加細胞懸液200 μl，下室中加入含10%胎牛血清DMEM培養基500 μl。將小室置于孵箱(條件為5%CO2、37℃)中孵育24 h后取出。輕輕擦去上室中細胞，以4%甲醇固定10 min后，加吉姆薩染色5 min。經漂洗液清洗晾干后，置于200倍顯微鏡下觀察。隨機取5個視野，統計穿膜細胞數目，計算平均值。每組實驗重復3次。

1.7細胞凋亡實驗 取4組細胞，以預冷的磷酸緩沖液洗滌細胞后，離心棄上清，加入200 μl結合緩沖液重懸細胞后，分別加入體積均為5 μl Annexin V/FITC和PI進行雙染色。37℃下避光反應20 min后，上流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況。每組實驗重復3次。

1.8統計學分析 應用SPSS21.0軟件進行t檢驗和單因素方差分析。

2 結 果

2.1高糖誘導下調TGIF2表達及轉染效果 與對照組相比，高糖組、NC高糖組和TGIF2高糖組HUVECs細胞中TGIF2 mRNA和蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)；與高糖組相比，NC高糖組細胞差異均無統計學意義(P>0.05)，而TGIF2高糖組均顯著升高(P<0.05)。見表1，圖1。

圖1 Western印跡檢測結果

組別TGIF2mRNATGIF2蛋白對照組101±005054±003高糖組042±0031)020±0021)NC高糖組040±0021)018±0031)TGIF2高糖組073±0061)2)041±0051)2)F/P值135676/000076489/0000

與對照組比較：1)P<0.05；與高糖組比較：2)P<0.05，下表同

2.2上調TGIF2表達減弱高糖對HUVECs細胞增殖的抑制作用 在相同作用時間下，與對照組相比，高糖組、NC組和TGIF2高糖組中HUVECs細胞活力均明顯降低(P<0.05)；而高糖組和NC高糖組間細胞活力無顯著變化(P>0.05)，但TGIF2高糖組細胞活力顯著高于高糖組(P<0.05)。見表2。

表2 各組HUVECs細胞在570 nm處的OD值

2.3上調TGIF2表達減弱高糖對HUVECs細胞遷移的抑制作用 與對照組穿膜細胞數〔(81.0±7.8)個〕比較，高糖組、NC高糖組、TGIF2高糖組〔(52.5±5.0)、(49.2±6.5)、(65.5±4.2)個〕HUVECs細胞的遷移能力均明顯降低(P<0.05)；而NC高糖組較高糖組無顯著變化(P>0.05)，但TGIF2高糖組較高糖組顯著增強(P<0.05)。

2.4上調TGIF2表達抑制高糖誘導的HUVECs細胞凋亡 高糖處理后HUVECs細胞的凋亡率顯著高于對照組(5.28%±0.35%，P<0.05)；與高糖組(16.45%±2.02%)比較，NC高糖組(15.76%±1.63%)差異無統計學意義(P>0.05)，但TGIF2高糖組(10.06%±1.25%)顯著降低(P<0.05)。

3 討 論

有研究顯示，糖尿病患者發生心腦血管疾病的概率明顯高于非糖尿病患者〔5〕。糖尿病血管并發癥是糖尿病患者中最為嚴重的并發癥之一，高糖是其重要誘因。血管內皮細胞功能受損是糖尿病血管病變的重要機制〔6〕。血管內皮細胞增殖、遷移和凋亡與糖尿病血管病的發生發展關系密切，尋找有效的治療靶點進行早期干預對治療和緩解糖尿病血管并發癥具有重要意義。

TGIF2可結合DNA或與Smads相互作用抑制TGFp基因表達發揮抑制作用，參與如癌癥、骨質疏松等生理病理過程〔7～9〕。Hu等〔10～12〕研究表明，TGIF2是miR-34a基因的靶基因，miR-34a能夠通過下調TGIF2表達，調控胃癌細胞侵襲和轉移、減輕激素誘導的股骨頭缺血性壞死和抑制多發性骨髓瘤腫瘤干細胞的生長。Shen等〔13〕指出，miR-34a在糖尿病患者外周血中高表達；同時，Li等〔14〕發現，氧化應激蛋白p66Shc能夠通過誘導miR-34a產生，導致糖尿病血管內皮功能障礙；另外，TGIF2在糖尿病胰島β細胞的分化和形成中發揮重要的促進作用〔4〕。因此推測TGIF2也可能在糖尿病血管內皮損傷方面發揮重要作用。楊亞麗等〔15〕研究發現，TGIF2在膠質瘤組織中高表達，沉默其表達能顯著抑制A172細胞增殖、遷移能力，并促進凋亡。目前，糖尿病血管內皮損傷的發生和發展機制尚不明確，本研究結果提示，TGIF2可能在糖尿病血管內皮損傷過程中發揮著抑制HUVECs細胞增殖和遷移，促進細胞凋亡的作用。

綜上，在高糖作用下，HUVECs細胞中TGIF2低表達，在血管內皮損傷中發揮重要作用；上調TGIF2表達后，對高糖引起的血管內皮損傷有一定的改善作用。

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