固本舒喘顆粒對哮喘豚鼠的免疫調節作用

俞 琦 馮 果 田維毅

(貴陽中醫學院基礎醫學院，貴州 貴陽 550025)

固本舒喘湯原方由黃芪、何首烏、地龍、苦參、防風等十味中藥組成，對支氣管哮喘防治效果顯著〔1〕。前期研究〔2〕在固定處方的基礎上，將湯劑制成固本舒喘顆粒，并建立了穩定、可控的質量標準。目前普遍認為哮喘的發病機制與免疫失衡有密切關系，本研究探討固本舒喘顆粒治療哮喘的部分免疫機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級健康豚鼠50只，雌雄各半，體重180～200 g，購自貴州醫科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(黔)20020001。動物隨機分為正常對照組、模型對照組、固本舒喘顆粒大、小劑量組、潑尼松組各10只。

1.2藥物和主要試劑 自制固本舒喘顆粒，批號：20081102。卵白蛋白(廈門市健眾生物制品工程有限公司)，Diff快速染色液(上海鈺博生物科技有限公司，批號：YB40748ES60)，醋酸潑尼松片(上海信誼藥廠有限公司，批號：100502)，豚鼠免疫球蛋白(Ig)E試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)，白細胞介素(IL)-4、IL-5、干擾素(IFN)-γ試劑盒(北京雅安達生物技術有限公司)。

1.3儀器 電子分析天平(梅特勒上海公司)，高速低溫離心機5804D(德國Eppendorf公司)，超聲霧化器(上海天源醫用生物有限公司)，ELX800全自動酶標儀(美國BioTek公司)。

1.4制備哮喘模型 參照文獻方法〔3〕造模。正常對照組除外，其余4 組每只豚鼠分別用10%卵白蛋白腹腔注射，1 ml/只。首次致敏15 d后，將致敏豚鼠置于4 L密閉玻璃罩中，按400 mmHg恒壓噴入5%卵白蛋白溶液0.5 min，激發至豚鼠出現煩躁、打噴嚏、呼吸急促、腹肌強烈收縮及伏地現象，為造模成功標準。1次/d，共激發7 d。

1.5給藥 于霧化當天開始灌胃給藥，根據制劑研究結果確定的用藥劑量，用生理鹽水稀釋藥物，固本舒喘顆粒大、小劑量組分別以10、5 g/kg，潑尼松組以0.001 g/kg灌胃給藥，灌胃體積為0.5 ml/100 g體重，正常對照組代以等體積生理鹽水，每天1 次，連續7 d。參照文獻〔4〕，觀察豚鼠發生呼吸困難、咳嗽的情況，判斷豚鼠反應級數。分級方法：1級，僅見呼吸困難；2級，可見呼吸困難和咳嗽；3級，呼吸困難、咳嗽、甚至休克跌倒。

1.6血清IgE、IL-4、IL-5和IFN-γ的測定 末次霧化24 h后，股動脈取血，3 500 r/min離心10 min，分離血清，酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清IgE、IL-4、IL-5和IFN-γ水平，具體操作按試劑盒說明進行。

1.7細胞計數 豚鼠末次霧化24 h后，開胸結扎右主支氣管，用37℃無菌生理鹽水5 ml推入右主支氣管進行灌洗，反復抽吸3次，回收灌洗液。肺泡灌洗液(BALF)經4℃，2 000 r/min離心10 min，用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸沉淀細胞，取5 μl進行細胞計數；取10 μl常規涂片，進行Diff-Quick快速染色，顯微鏡下分類計數細胞(至少連續計數300個細胞)。

1.8統計學方法 應用SPSS18.0軟件進行t檢驗，方差分析。

2 結 果

2.1各組氣道反應級數比較 激發后，模型對照組氣道反應性顯著增高，出現躁動，呼吸急促，抽搐等表現，休克死亡1只。與模型對照組(2.43±0.33)比較，潑尼松組、固本舒喘顆粒大、小劑量組反應級數均明顯降低(1.40±0.13、1.60±0.29、2.10±0.25；P<0.05，P<0.01)。

2.2各組血清IgE水平比較 與正常對照組〔(25.96±2.37)μg/ml〕比較，模型對照組血清IgE水平顯著升高〔(48.30±3.64)μg/ml,P<0.01〕。與模型對照組比較，潑尼松組和固本舒喘顆粒大、小劑量組IgE水平明顯下降〔(30.74±2.30)、(32.09±2.72)、(36.80±3.41)μg/ml,P<0.01〕。

2.3各組血清細胞因子比較 與正常對照組比較，模型對照組血清中IL-4、IL-5水平明顯升高，IFN-γ水平顯著降低(P<0.01)。與模型對照組比較，固本舒喘顆粒各劑量組和潑尼松組均能顯著降低豚鼠血清IL-4水平(P<0.05或P<0.01)，提高IFN-γ水平(P<0.01)；固本舒喘顆粒大劑量組、潑尼松組能明顯降低IL-5水平(P<0.01)，見表1。

表1 各組血清細胞因子比較

與正常對照組比較:1)P<0.01；與模型對照組比較：2)P<0.05，3)P<0.01，下表同

2.4各組BALF炎癥細胞表達比較 與正常對照組比較，模型對照組BALF中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞及細胞總數明顯上升(P<0.01)。與模型對照組比較，潑尼松組和固本舒喘顆粒大、小劑量組均能顯著降低BALF細胞總數和炎癥細胞的表達(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表2 固本舒喘顆粒對哮喘模型豚鼠BALF炎癥細胞表達的影響

3 討 論

哮喘的發病機制非常復雜，現代醫學認為，哮喘的發病與諸多炎癥細胞、生物介質等多種免疫因素有關〔5〕，機體免疫異常在哮喘的發病中占據核心地位〔6〕。研究發現，嗜酸性粒細胞在氣道內聚集和激活能直接促發氣道炎癥反應，其數量與病情的嚴重程度呈正相關〔7〕；中性粒細胞可分泌氧代謝類、酶類和花生四烯酸等代謝產物，誘導多種細胞因子合成與釋放〔8〕；淋巴細胞和巨噬細胞也是引發哮喘氣道炎癥的關鍵角色。輔助性T細胞(Th)1/Th2免疫失衡一直被認為是哮喘發病的關鍵環節，在整個氣道炎癥過程乃至氣道重塑發生過程中，都起著極其重要的作用〔9，10〕。Th2型細胞主要分泌IL-4，IL-5等細胞因子，可正向調節IgE生成與活性，刺激嗜酸粒細胞增殖、活化，并同時引起組胺、白三烯等多種炎性介質釋放〔11，12〕；IFN-γ由Th1細胞分泌，主要參與細胞分化的調節，能抑制Th2型細胞的活性，從而對氣道炎癥產生有效的抑制作用〔11〕。除以上免疫因素外，氣道反應性和血清IgE水平也是反映哮喘炎癥反應的重要指標〔13〕。固本舒喘顆粒原方具有益氣和衛、和血祛風、納氣平喘之功效，主要用于氣虛衛弱、衛氣不固所致的虛喘之癥。本研究結果均提示固本舒喘顆粒具有顯著免疫調節作用，其治療哮喘的作用機制可能與其下調血清IgE、IL-4和IL-5水平，上調IFN-γ表達及降低肺泡炎癥細胞數量有關。

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7唐以軍，徐永健，熊盛道，等.動態監測哮喘患者誘導痰嗜酸性粒細胞的臨床意義〔J〕.臨床內科雜志，2003；20(9)：463-5.

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12王明明.補肺益腎方對幼齡哮喘豚鼠模型IL-5信號通路的調控機制〔J〕.長春中醫藥大學學報，2016；32(2)：234-7.

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