浸潤性肺腺癌術后組織中跨膜蛋白-1及其受體和基質金屬蛋白酶-9表達及關系

周 亮 陳其玖 張建勇 劉 波 馬 龍

(遵義醫學院附屬醫院呼吸科，貴州 遵義 563000)

肺癌病變常由肺泡上皮的不典型增生及原位腺癌轉變而來，形成浸潤性腺癌后病變進展迅速〔1〕。跨膜蛋白(PD)-1是Ⅰ型跨膜糖蛋白，PD-L1是其配體，有共刺激性和共抑制性，腫瘤細胞高表達PD-L1，與PD-1結合后，激活PD-1/PD-L1 信號系統，抑制細胞毒性T淋巴細胞的活性，使T淋巴細胞阻滯在G0/G1期，阻礙其分化為漿細胞，從而引起T淋巴細胞發生凋亡，激活腫瘤細胞的免疫逃逸，促進腫瘤的發生和發展〔2〕。基質金屬蛋白酶(MMP)-9不僅是調節細胞外基質降解的蛋白，還對腫瘤的血管生成、腫瘤的間質侵犯起明顯促進作用〔3〕。本實驗檢測浸潤性肺腺癌術后組織中PD-1、PD-L1和MMP-9的半定量表達，探討其臨床價值。

1 資料與方法

1.1臨床資料 2014年1月至2016年12月遵義醫學院附屬醫院經病理醫師確診為浸潤性肺腺癌的患者75例為觀察組，均行根治手術，術后留取新鮮的腫瘤標本，置于70%的酒精中保存。年齡50～87歲，平均66.8歲。排除標準：①多原發癌；②有肺部手術史；③伴有其他嚴重內臟器官疾病。其中有轉移19例，無轉移56例。選擇上述患者中距腫物邊緣>3 cm的36例正常肺組織為對照組，年齡52～83歲，平均64.3歲，其中男20例，女16例。標本留取方法同上。兩組在一般資料差異無統計學意義。

1.2PD-1、PD-L1和MMP-9蛋白的檢測 將術后應用酒精固定的組織取出，用眼科剪子剪成粉末狀，置于銅網上輕搓，用0.9%的鹽水沖洗后，再次過濾。離心，將組織制備成單細胞懸液。每次檢測均取1 ml單細胞懸液后加入一抗、磷酸鹽緩沖液(PBS)及異硫氰酸熒光素(FITC)-IgG二抗，均嚴格操作方法，應用美國BC公司生產的Epics-XLⅡ型流式細胞儀，應用系統自帶的軟件(Expo 32 ADC)進行數據分析。

1.3結果判定 應用熒光指數(FI)為結果表達值。FI=(腫瘤中蛋白表達的熒光強度-對照樣品平均熒光強度)/正常對照樣品平均熒光強度。

1.4統計學方法 應用SAS6.12統計軟件進行t檢驗，方差分析，線性相關分析。

2 結 果

2.1PD-1、PD-L1和MMP-9在兩組中的表達 PD-1、PD-L1和MMP-9在觀察組中表達量明顯高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 PD-1、PD-L1和MMP-9在兩組中表達

2.2PD-1、PD-L1和MMP-9的表達在觀察組不同臨床病理特征中的比較 PD-1、PD-L1和MMP-9的表達量均與腫瘤最大徑和增殖指數有關，MMP-9的表達量與淋巴結轉移有關，三者均與腫瘤的性別、年齡無關。見表2。

2.3觀察組PD-1、PD-L1和MMP-9的相關性 PD-1和MMP-9、PD-L1和MMP-9的表達均無明顯相關性(P>0.05)。

表2 PD-1、PD-L1和MMP-9的表達在觀察組不同臨床病理特征中的比較

3 討 論

浸潤性肺腺癌常見類型有腺泡型、乳頭型、黏液型、非黏液型、胎兒型、透明細胞型等〔4〕。腫瘤細胞間質中可見到以淋巴細胞為主的炎細胞浸潤。淋巴細胞作為腫瘤間質微環境中的重要成分，參與腫瘤的進展及免疫性微環境的形成過程。機體對抗腫瘤細胞重要的是細胞免疫，T淋巴細胞是重要角色，T淋巴細胞能抑制或殺滅腫瘤細胞〔5〕。T淋巴細胞激活需要兩個信號的協同作用：T淋巴細胞激發的第一信號是T淋巴細胞受體識別主要組織相容性復合體(MHC)-抗原復合物，即T淋巴細胞對抗原的特異性識別；第二信號是抗原遞呈細胞(APC)所表達的共刺激分子與T細胞所表達的共刺激分子受體結合，傳遞的共刺激信號〔6〕。PD-1是一種50～55 kD的Ⅰ型跨膜糖蛋白，是B7-CD28家族成員，主要以細胞表面受體形式表達于T細胞、B細胞、單核細胞及自然殺傷細胞，目前其有PD-L1和PD-L2兩個配體，主要表達于APC上，其作用主要是抑制信號傳遞到T細胞受體。也有研究認為其可以增加P15的表達同時抑制細胞周期調控因子細胞S期激酶相關蛋白(SKP)2轉錄，使細胞停滯于G1期〔7〕。研究顯示PD-1通路參與慢性感染的免疫性調節，高表達時可以耗盡持續活化的T細胞，使T細胞喪失增殖和消滅侵入機體的微生物的功能，使感染持續存在。喪失活性的T細胞可以減少機體免疫性的損傷〔8〕。在腫瘤細胞中，PD-L1可以作為抗凋亡因子起作用，表達到APC上的PD-L1可與T細胞的相關蛋白結合，降低T細胞活性和細胞因子的生成，同時可以上調PD-L1的表達，使T細胞釋放干擾素，引起失活的T細胞表達PD-1，進一步引起腫瘤細胞獲得逃避免疫清除的能力。MMP-9正常情況表達于腫瘤細胞，尤其是高轉移潛能的腫瘤細胞，其可以促進腫瘤細胞周圍基質和基底膜發生降解，引起腫瘤細胞離開原灶并形成遷移，同質性黏附和異質性黏附共同起作用，使腫瘤細胞出現轉移〔9〕。

本文結果顯示PD-1、PD-L1和MMP-9三者高表達是促進腫瘤細胞生成的重要因素。由于PD-1表達于間質，是細胞微環境的一部分，其在流式細胞半定量時表達較好。本文結果顯示PD-1、PD-L1和MMP-9三者高表達可以促進腫瘤的生長及細胞增殖。PD-L1可以在腫瘤細胞中表達，而正常機體的細胞中常不表達。PD-1通路能降低腫瘤局部微環境T細胞免疫效應，介導腫瘤免疫逃逸，引起腫瘤的生長〔10〕。其機制有：①誘導并增加T細胞數量；②增強腫瘤特異性的殺傷活性；③使促炎相關因子高表達；④引起T細胞聚集現象；⑤下調潛在的抑制性細胞因子。有研究認為PD-1和PD-L1是負性共刺激分子，腫瘤細胞高表達 PD-L1，其與PD-1結合后，傳導抑制性信號，減少 CD8+T淋巴細胞增殖，甚至誘導T淋巴細胞凋亡，導致機體抗腫瘤免疫反應下降，腫瘤細胞得以發生、發展〔11〕。而且PD-1/PD-L1信號通路可以抑制干擾素的產生，刺激T淋巴細胞分泌白細胞介素10，抑制T細胞的活性〔12〕。本文結果提示MMP-9高表達時可以促進腫瘤淋巴道播散。MMP-9是轉移相關的蛋白，其具有多向調節作用，如對血管生成的調節作用、促進細胞增殖等〔13，14〕，本實驗提示PD-1、PD-L1和MMP-9三者間無協同作用，因此PD-1/PD-L1和MMP-9的調節可能是通過各自的通路完成的。

1邱雪杉，李慶昌，謝成耀，等.非小細胞肺癌中MMP-9、TIMP-1表達與轉移和預后的關系〔J〕.中華結核和呼吸雜志，2003；26(1)：55-7.

2Dincecco A，Andreozzi M，Ludovini V，etal.PD-1 and PD-L1 expression in molecularly selected non-small-cell lung cancer patients〔J〕.Brit J Cancer，2015；112(1)：95-7.

3羅 彬，秦 蓁，王旭東.肺癌MMP-9、TIMP-1表達與微血管密度的關系及意義〔J〕.臨床與實驗病理學雜志，2009；25(5)：510-2.

4Ohaegbulam KC，Assal A，Lazar-Molnar E，etal.Human cancer immunotherapy with antibodies to the PD-1 and PD-L1 pathway〔J〕.Trends Molec Med，2015；21(1)：24-33.

5Soares KC，Rucki AA，Wu AA，etal.PD-1/PD-L1 blockade together with vaccine therapy facilitates effector T-cell infiltration into pancreatic tumors〔J〕.J Immunother，2015；38(1)：1-2.

6Zhang Y，Kang S，Shen J，etal.Prognostic significance of programmed cell death 1 (PD-1) or PD-1 ligand 1(PD-L1) expression in epithelial-originated cancer：a meta-analysis〔J〕.Medicine，2015；94(6)：e515.

7李明彪，徐 嵩，范海洋，等.PD-1和PD-L1在肺類癌中的表達情況和其臨床意義〔J〕.中國肺癌雜志，2016；19(12)：847-53.

8Dezutter-Dambuyant C，Durand I，Alberti L，etal.A novel regulation of PD-1 ligands on mesenchymal stromal cells through MMP-mediated proteolytic cleavage〔J〕.Oncoimmunology，2016；5(3)：e1091146.

9付 偉，呂 錚，劉愛東，等.非小細胞肺癌組織中MMP-9和E-cadherin的表達變化及意義〔J〕.山東醫藥，2009；49(10)：69-70.

10Lei Z，Cheng L，Fei L，etal.A blockade of PD-L1 produced antitumor and antimetastatic effects in an orthotopic mouse pancreatic cancer model via the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway〔J〕.Oncotargets Ther，2017；10(10)：2115-26.

11冷雪嬌，王建豐，徐云華，等.PD-L1對肺癌細胞遷移能力的影響〔J〕.現代腫瘤醫學，2017；25(9)：1341-5.

12馬 薇，羅殿中，陳 源，等.PD-L1和PD-1在非小細胞肺癌中的表達及其臨床意義〔J〕.實用醫學雜志，2011；27(9)：1551-4.

13曹紀偉，劉德森，潘 泓，等.非小細胞肺癌MMP-9、TIMP-1的表達與轉移預后的相關性研究〔J〕.中國癌癥防治雜志，2010；2(3)：179-82.

14薛 洋，周清華，張尚福，等.MMP-2、MMP-9在肺癌中的表達及其與肺癌轉移和預后關系的研究〔J〕.華西醫學，2008；23(2)：225-7.