異煙肼對肝細胞CYP2E1和GSTP1表達的影響*

李瑩淑，李金鳳，張一楊，崇英之，杜 瑩，李玉紅，鄭國穎，韓鐵生，馮福民

(華北理工大學公共衛生學院 /河北省煤礦衛生與安全重點實驗室，河北唐山 063000)

異煙肼(isoniazid，INH)作為抗結核治療方案中不可替代的首選藥物具有一定的肝毒性，能夠引起抗結核藥物性肝損傷(anti-tuberclosis drug-induced liver injury，ADLI)[1]。異煙肼通過Ⅰ相代謝酶細胞色素P450(CYP450)與Ⅱ相代謝酶谷胱甘肽(GSH)解毒，當毒性代謝產物大量生成就會耗竭肝內GSH，產生親電子基、自由基。研究表明過量的親電子基、自由基會激活JNK通路，造成凋亡指標JNK、Bax增加，抗凋亡指標Bcl2減少，導致細胞凋亡[2]。所以藥物毒性代謝產物的積累和解毒過程取決于Ⅰ相、Ⅱ相酶之間的平衡[3]。已有研究證明CYP2E1、GSTP1基因CpG島甲基化和基因多態性與抗結核藥物性肝損傷有關，從遺傳學和表觀遺傳學兩方面說明CYP2E1、GSTP1兩個基因與ADLI有關[4-6]。組蛋白乙酰化屬于表觀遺傳學的研究范圍，研究表明異煙肼給藥3 d后大鼠肝臟HAT活性降低，HDAC活性升高[7]。本實驗旨在研究異煙肼、乙酰化酶抑制劑Garcinol及去乙酰化酶抑制劑TSA引起的肝細胞組蛋白乙酰化水平改變對藥物代謝酶CYP2E1、GSTP1表達的影響，為有效預防及治療ADLI提供新的參考。

1 材料與方法

1.1實驗材料 人正常肝細胞HL-7702購自上海中科院。用含90%RPMI 1640(CORNING)、10%胎牛血清(CLARK)、1%雙抗的培養液作為HL-7702細胞的培養基，細胞放置于5%CO2、37 ℃細胞培養箱中進行培養。

1.2儀器與試劑 異煙肼(日本TCI公司)，Garcinol(Cayman公司)，TSA(TCI公司)，二甲基亞砜(DMSO，TCI公司)，TRI Pure Reagent 總RNA抽提試劑盒(北京百泰克公司)，Prime ScriptTMRT Master Mix試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ PCR試劑盒(大連TaKaRa公司)，丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，HAT酶活性試劑盒、HDAC酶活性試劑盒、CYP2E1蛋白含量試劑盒、GSTP1蛋白含量試劑盒(北京綠源大德生物科技有限公司)。Heraeus高速冷凍離心機(德國Thermo Scientific公司)C1000PCR擴增儀(美國BIO-RAD公司)，熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems 公司)，CA94089型連續光譜酶標儀(美國Molecular Devices分子儀器公司)。

1.3方法

1.3.1細胞培養 取對數生長期細胞，調整細胞濃度為1×105/mL，接種于6孔板上，每孔2 mL，分為6組，分別為對照組、INH組、INH+Garcinol組、Garcinol組、INH+TSA組、TSA組，每組6個副孔于6孔板中培養24 h后分別加入藥物和抑制劑，藥物濃度為800 g/L，Garcinol濃度為5 μmol/L，TSA濃度為1 μmol/L。3 h后收集細胞及細胞培養液進行檢測。

1.3.2肝功能指標ALT、AST水平的檢測 收集細胞培養上清液，嚴格按照ALT、AST檢測試劑盒說明書操作，測定各指標水平。

1.3.3肝細胞HAT、HDAC酶活性檢測 收集細胞離心后棄上清液，加入細胞裂解液4 ℃震蕩20 min，14 000 r/min離心15 min取上清液，嚴格按照ELISA試劑盒說明書檢測HAT、HDAC活性。

1.3.4肝細胞CYP2E1、GSTP1、JNK、Bax、Bcl-2 mRNA檢測 收集細胞，常規 TRIzol法提取總RNA，反轉錄和實時熒光定量 PCR嚴格按照試劑盒說明書進行操作。以GAPDH為內參，用 來表示各RNA的相對表達量。引物均由上海生工合成，其序列見表1，反轉錄反應條件:37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 1 min;定量PCR反應條件:95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。

1.3.5肝細胞CYP2E1、GSTP1蛋白檢測 收集細胞離心棄上清液，加入細胞裂解液4 ℃震蕩20 min，14 000 r/min離心15 min取上清液，CYP2E1 和GSTP1 蛋白含量采用酶聯免疫吸附試劑盒進行檢測，嚴格按照試劑盒說明書操作。

表1 擴增基因和引物序列

2 結 果

2.1INH、Garcinol及TSA對肝細胞ALT、AST的影響 INH組與對照組相比ALT、AST酶活性增加(P<0.05)，Garcinol組、TSA組分別與對照組ALT、AST酶活差異無統計學意義(P>0.05)，提示異煙肼造成肝細胞損傷，Garcinol與TSA對肝細胞無影響；INH+Garcinol與INH組相比ALT、AST酶活性降低(P<0.05)；INH+TSA與INH組相比ALT、AST酶活性降低(P<0.05)，見圖1。

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與INH組比較

圖1各組細胞上清液中ALT、AST含量比較

2.2INH及抑制劑對肝細胞HAT活性和HDAC活性的影響 與對照組相比INH組肝細胞HAT活性降低(P<0.05)，Garcinol組肝細胞HAT活性降低(P<0.05)(圖2A)，與對照組相比INH組肝細胞HDAC活性增加(P<0.05)，TSA組HDAC活性降低(P<0.05)(圖2B)，提示INH影響肝細胞乙酰化的平衡，且Garcinol與TSA對HAT、HDAC分別有抑制作用；INH+Garcinol組與INH組比HAT活性降低(P<0.05)(圖2A)。INH+TSA組與INH組比HDAC活性降低(P<0.05)(圖2B)。

A：各組細胞HAT活性比較；B：各組細胞HDAC活性比較；a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與INH組相比

圖2各組細胞上清液中HAT、HDAC酶活性比較

2.3INH及抑制劑對肝細胞CYP2E1、GSTP1 mRNA和蛋白含量的影響 INH組與對照組比較CYP2E1 mRNA和蛋白表達量均增加(P<0.05)，GSTP1 mRNA和蛋白表達量均減少(P<0.05)，INH+Garcinol組與INH組比CYP2E1 mRNA和蛋白表達量都減少(P<0.05)，GSTP1 mRNA和蛋白表達量均減少(P<0.05)其他組與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。INH+TSA組與INH組比CYP2E1mRNA和蛋白表達量均增加(P<0.05)，GSTP1 mRNA和蛋白表達量均增加(P<0.05)，TSA能逆轉INH導致的GSTP1降低，但也使INH導致升高的CYP2E1繼續增加，見圖3。

2.4INH、Garcinol及TSA對肝細胞JNK、Bax、Bcl2 mRNA的影響 INH組與對照組相比JNK mRNA、

A：CYP2E1；B：CYP2E1 mRNA；C：GSTP1；D：GSTP1 mRNA；a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與INH組比較

圖3各組CYP2E1 mRNA、CYP2E1蛋白、GSTP1 mRNA、GSTP1蛋白比較

Bax mRNA增加，Bcl2 mRNA減少(P<0.05)，INH+Garcinol組與INH+TSA組分別與INH組相比JNK mRNA、Bax mRNA減少(P<0.05)，Bcl2 mRNA增加(P<0.05)，見圖4。

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與INH組相比。

圖4各組JNK mRNA、Baxm RNA、Bcl-2 mRNA水平比較

3 討 論

組蛋白乙酰化修飾是動態可逆的，HAT和HDAC共同調節，HAT通過將乙酰輔酶A上的乙酰基轉移到組蛋白氨基端特定的賴氨酸殘基上完成乙酰化修飾[8-10]。在藥物性肝損傷的研究中，組蛋白乙酰化被證實參與到肝損傷的發生過程中[11]。本研究發現INH作用肝細胞3 h后肝損傷指標ALT、AST增加，同時HAT活性降低HDAC活性增加，這與本團隊之前在大鼠實驗中的出的結論一致。研究報道Garcinol對 LPS/D-Gal 誘導的肝損傷具有保護作用，這一保護效應不伴隨有肝內炎癥因子的表達降低，可能通過抑制 p53 的乙酰化修飾、降低其活性，從而下調促凋亡蛋白Bax、抑制肝細胞凋亡[12]。TSA是一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑，能使肝癌細胞CYP2E1表達增加促進肝癌細胞凋亡[13]。本實驗中Garcinol與TSA分別對HAT與HDAC活性有抑制作用。

CYP2E1和GSTP1為Ⅰ、Ⅱ相藥物代謝酶CYP450和GST家族的重要成員，研究已發現，其基因多態性與ADLI有關，可以作為疾病診斷及預后的潛在分子生物標志物。CYP2E1在人肝臟中含量最為豐富[4-6]，并且富集于肝小葉中心區域，人類CYP2E1是細胞色素P450超家族中的重要成員之一，約占P450總量的7%左右[14-15]，參與多種藥物的代謝，大約有60%的藥物是由通過CYP450的作用清除的。GSTP1為體內Ⅱ相物質代謝酶，催化GSH與親電子物質結合，將之轉化為親水性物質，經尿液或膽汁排出體外，這一過程為解毒反應。本研究中INH致肝細胞CYP2E1 mRNA及蛋白增加，GSTP1 mRNA及蛋白減少，說明INH可能改變Ⅰ、Ⅱ相藥物代謝酶的表達和翻譯，HAT活性降低HDAC活性增加可以抑制基因表達，本實驗中INH導致GSTP1降低，但CYP2E1表達增加，由于乙酰化酶家族和去乙酰化家族包括很多酶，本實驗檢測的總的HAT活性的變化是降低的，當抑制HAT活性后CYP2E1的表達會降低，筆者推斷可能作用在CYP2E1基因啟動子區的某種乙酰酶是升高的。

CYP450在抗結核藥物代謝肝臟解毒過程中發揮重要作用，研究報道CYP2E1可以通過其代謝產物自由基激活JNK通路導致凋亡進而引起肝損傷[2]。本研究中INH組與對照組相比凋亡指標JNK、Bax表達增加，抗凋亡指標Bcl2表達減少說明肝細胞發生了凋亡。INH+Garcinol組與INH+TSA組分別與INH組相比JNK、Bax表達減少，抗凋亡指標Bcl2表達增加，說明Garcinol與TSA均能逆轉凋亡。出現此變化可能由于Carcinol使CYP2E1和GSTP1表達均減少，降低INH代謝產生的毒性代謝產物；而TSA使CYP2E1和GSTP1表達均增加，促進毒性代謝產物的代謝而解毒。

綜上所述，INH致肝損傷的原因可能是HAT與HDAC活性改變進而影響藥物代謝酶CYP2E1、GSTP1的轉錄和表達的改變。對于組蛋白乙酰化是如何具體調控CYP2E1、GSTP1表達的機制仍需深入研究，為ADLI的預防和治療提供更詳盡的證據。

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