TGF-β1促進人胃癌MKN28細胞上皮-間質轉化和轉移的研究

孫 云，馬國娟，胡曉杰，尹香云，彭彥輝

(河北省人民醫院：1.普外四科;2.門診部;3.普外三科,石家莊 050051)

研究表明，上皮-間質轉化(epithelia to mesenchymaltransition，EMT)在腫瘤侵襲轉移中發揮重要作用，它是指上皮細胞在形態學上向間質細胞轉變，在此過程中細胞浸潤和遷移能力明顯增強[1-2]。轉化生長因子-β1(the transforming growth factor-β1,TGF-β1)是EMT的重要誘導因子，在細胞增殖、分化、凋亡中發揮重要作用。研究顯示，進展期胃癌患者TGF-β1表達升高，通過促進細胞EMT進程，增強腫瘤細胞的侵襲遷移能力[3]。但是，胃癌中TGF-β1調控EMT的分子機制尚不清楚。LMO1是由2個LIM結構域組成的輔助轉錄因子，其LIM結構域可作為蛋白質相互作用的適配器，通過與其他蛋白相互作用形成復合體，調控基因轉錄活性，參與細胞分化、增殖等生物學過程[4]。研究顯示，LMO1在T淋巴細胞白血病、神經母細胞瘤、乳腺癌患者中表達升高，且與患者預后密切相關，提示LMO1在腫瘤發生、發展中發揮重要作用[5]。有研究顯示LMO家族其他成員LMO2、LMO4參與了EMT的調控[6]。然而，LMO1是否參與TGF-β1介導的EMT進程目前尚未見報道。本研究通過Real time-PCR和Western blot等技術探討LMO1在TGF-β1誘導的胃癌MKN28細胞EMT及轉移中的作用，為闡明胃癌發病機制及治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1細胞株與試劑 人胃癌MKN28細胞購自軍事醫學科學院；兔抗人E-cadherin、N-cadherin、LMO1、基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9,MMP-9)、血管內皮生長因子(vascular endoth elial growth factor,VEGF)多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體、BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自北京中杉金橋有限公司；胎牛血清、PRMI 1640培養基、Lipofectamine 2000、TGF-β1、Trizol、實時熒光定量試劑盒購自美國Invitrogen公司；LMO1 siRNA及陰性對照siRNA 由上海吉瑪基因化學技術有限公司合成；Transwell小室、Matrigel 基質膠購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 在37 ℃、5% CO2條件下，用含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養基常規培養細胞，2 d換液1次。將處于對數生長期的細胞接種于6孔板中，細胞分4組：對照組(5% BSA)、TGF-β1誘導組(10 μg/L)、陰性轉染組(TGF-β1+陰性轉染siRNA)、LMO1-siRNA轉染組(TGF-β1+LMO1-siRNA)。每組設3個復孔，重復3次。

1.2.2細胞轉染 根據Gene Bank中人LMO1基因序列設計特異性siRNA。LMO1-siRNA序列為：正義：5′-GGG CCC GAG ACA ATG TGT AT-3′，反義：5′-AGA CGG ACA GAT GGA CCT GG-3′;同時合成一條熒光素標記的陰性對照siRNA。收集處于對數生長期的MKN28細胞接種于6孔板中，調整細胞密度為2×105個/孔，利用脂質體Lipofectamine 2000轉染。轉染24 h后在熒光顯微鏡下觀察轉染效率，轉染48 h后收集細胞用于實驗。

1.2.3Real time-PCR檢測目的基因mRNA的表達 根據Gene Bank中人LMO1 mRNA序列，采用DNAMAN軟件設計引物，引物序列見表1，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。Trizol提取細胞總RNA，用紫外分光光度計測定RNA的純度和濃度。在ABI 7300型熒光定量PCR儀上進行反轉錄和擴增試驗。反應結束后采用儀器自帶的SDS v1.3軟件分析得出各樣本、各基因擴增的Ct值。設對照組樣品為標準1，目的基因表達水平的相對定量值RQ=2-ΔΔCt，將RQ值用于統計分析，以GAPDH為內參照基因。

表1 LMO1、E-cadherin、N-cadherin、GAPDH引物序列

1.2.4Western blot檢測目的基因蛋白質 細胞加入裂解液100 μL，冰上靜置30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，用BCA法進行蛋白定量。將50 μg總蛋白進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用10%脫脂奶粉封閉2 h，加入特異性E-cadherin、N-cadherin、LMO1、MMP-9、VEGF抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG，室溫孵育1 h，TBST清洗，ECL化學發光法顯色、定影。用UVP軟件檢測并分析蛋白條帶IOD值，以GAPDH作為內參照，以目的蛋白吸光度值/內參照吸光度值的比值進行定量分析。

1.2.5Transwell小室檢測細胞侵襲力 將Matrigel膠用PRMI 1640培養基稀釋后均勻涂于8 μm小孔聚碳酸酯濾膜的Transwell小室上室。收集轉染組和對照組MKN28細胞，用不含血清的PRMI 1640培養基重懸細胞，制備單細胞懸液(2×105個/mL)，取200 μL單細胞懸液接種于Transwell小室的上室，下室加入含10%胎牛血清(FBS)的PRMI 1640培養基800 μL。培養24 h后取出Transuell小室，用棉簽擦拭掉小室底部未轉移的細胞，用4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結晶紫染色15 min。在倒置顯微鏡下隨機選取10個視野(×200)計算穿膜細胞數，求均值。

表2 TGF-β1誘導對胃癌MKN28細胞E-cadherin、N-cadherin、LMO1表達的影響

*：P<0.01,與對照組比較;▲：P<0.01，與TGF-β1誘導組、陰性轉染組比較

1.2.6Transwell小室檢測細胞遷移能力 Transwell小室不涂抹Matrigel膠，其余步驟同1.2.5。

2 結 果

2.1TGF-β1誘導對胃癌MKN28細胞形態學的影響 對照組細胞仍表現為上皮細胞形態，細胞呈鵝卵石樣，且細胞間連接緊密。TGF-β1誘導組和陰性轉染組細胞由緊密連接的多角形變為長梭形或紡錘體形，細胞多分散，呈典型的EMT形態改變。LMO1-siRNA轉染組部分細胞恢復成梭形，細胞間連接略疏松，即LMO1-siRNA特異性下調LMO1能夠明顯減弱TGF-β1誘導MKN28細胞引起的EMT形態改變。

A:對照組；B:TGF-β1誘導組；C:陰性轉染組；D:LMO1-siRNA轉染組

圖1 Western blot檢測各組E-cadherin、N-cadherin、LMO1表達情況

2.2TGF-β1誘導對胃癌MKN28細胞EMT相關標志物及LMO1表達的影響 Real time-PCR和Western blot結果顯示，與對照組比較，TGF-β1誘導組和陰性轉染組E-cadherin表達顯著下降，N-cadherin、LMO1表達顯著上升(P<0.01)，TGF-β1誘導組和陰性轉染組比較差異無統計學意義(P>0.05)；LMO1-siRNA轉染組E-cadherin表達較TGF-β1誘導組和陰性轉染組顯著回升，N-cadherin、LMO1表達較TGF-β1誘導組和陰性轉染組顯著降低(P<0.01)，但和對照組比較差異仍有統計學意義(P<0.01),見表2，圖1。

2.3TGF-β1誘導對各組胃癌MKN28細胞侵襲能力的影響 Transwell小室侵襲實驗結果顯示，TGF-β1誘導組、陰性轉染組穿膜細胞數分別為(312±22)個和(318±26)個，較對照組[(116±18)個]顯著增加(P<0.01)，TGF-β1誘導組和陰性轉染組比較差異無統計學意義(P>0.05)；與TGF-β1誘導組、陰性轉染組比較，LMO1-siRNA轉染組穿膜細胞數[(197±20)個]顯著降低(P<0.01)，但與對照組比較差異仍有統計學意義(P<0.01),見圖2。

A:對照組；B:TGF-β1誘導組；C:陰性轉染組；D:LMO1-siRNA轉染組

圖2 TGF-β1誘導對各組胃癌MKN28細胞侵襲能力的影響

2.4TGF-β1誘導對各組胃癌MKN28細胞遷移能力的影響 Transwell小室遷移實驗結果顯示，TGF-β1誘導組、陰性轉染組穿膜細胞數分別為(458±28)個和(470±26)個，較對照組[(231±22)個]顯著增加(P<0.01)，TGF-β1誘導組和陰性轉染組比較差異無統計學意義(P>0.05)；與TGF-β1誘導組、陰性轉染組比較，LMO1-siRNA轉染組穿膜細胞數[(301±27)個]顯著降低(P<0.01)，但與對照組比較差異仍有統計學意義(P<0.01)，見圖3。

A:對照組；B:TGF-β1誘導組；C:陰性轉染組；D:LMO1-siRNA轉染組

圖3 TGF-β1誘導對各組胃癌MKN28細胞遷移能力的影響

2.5TGF-β1誘導對胃癌MKN28細胞侵襲轉移相關基因表達的影響 Western blot結果顯示，與對照組比較，TGF-β1誘導組和陰性轉染組MMP-9、VEGF表達顯著上升(P<0.01)，TGF-β1誘導組和陰性轉染組比較差異無統計學意義(P>0.05)；LMO1-siRNA轉染組MMP-9、VEGF表達較TGF-β1誘導組和陰性轉染組顯著下降(P<0.01)，但和對照組比較差異仍有統計學意義(P<0.01)，見表3、圖4。

表3 TGF-β1誘導對胃癌MKN28細胞MMP-9、VEGF表達的影響

*：P<0.01,與對照組比較;▲：P<0.01，與TGF-β1誘導組、陰性轉染組比較

A:對照組；B:TGF-β1誘導組；C:陰性轉染組；D:LMO1-siRNA轉染組

圖4 Western blot檢測各組MMP-9、VEGF表達情況

3 討 論

胃癌是來源于胃黏膜上皮的消化道惡性腫瘤，其發病率和死亡率極高，居惡性腫瘤的第2位[7]。侵襲和轉移是惡性腫瘤的重要特征，也是導致治療失敗的主要原因，據統計每年約有60%的胃癌患者死于復發和轉移[8]。因此，尋找與胃癌侵襲和轉移相關的靶向分子，對于深入探討胃癌發生、發展的分子機制并探索積極有效的治療措施、改善患者預后具有重要意義。

TGF-β1是TGF家族的重要成員，具有多種生物學功能，已有研究發現TGF-β1在誘導腫瘤細胞EMT進程中發揮關鍵作用[9-10]。TGF-β1可通過Smad依賴性和非Smad依賴性途徑介導腫瘤細胞EMT進程。LMO1是LMO家族成員，主要通過調控基因轉錄活性參與細胞分化、增殖等生物學過程[4]。研究顯示，LMO1與T淋巴細胞白血病、神經母細胞瘤、乳腺癌等惡性腫瘤發生、發展密切相關。患者LMO1表達升高，且與患者預后密切相關，提示LMO1在腫瘤發生、發展中發揮重要作用[5]。

本研究結果顯示，TGF-β1誘導人胃癌MKN28細胞后出現典型的EMT形態學變化，細胞由緊密連接的多角形變為長梭形或紡錘體形，細胞多分散。Real time-PCR和Western blot結果顯示，TGF-β1誘導后MKN28細胞EMT標志物E-cadherin表達顯著下調，N-cadherin表達顯著上調，說明TGF-β1是EMT的有效誘導因子，與HELDIN等[11]的報道一致。同時在TGF-β1誘導MKN28細胞出現的EMT進程中，LMO1表達顯著上調。SAEKI等[12]研究顯示，TGF-β1通過上調LMO1表達進而促進胃黏膜上皮細胞的凋亡進程，與本研究結果一致。本研究采用Tanswell小室實驗及Western blot檢測TGF-β1誘導后MKN28細胞侵襲遷移能力及轉移相關蛋白(MMP-9、VEGF)表達的變化。結果顯示，TGF-β1誘導后MKN28細胞侵襲遷移能力明顯增強，MMP-9、VEGF蛋白表達明顯上調，說明TGF-β1誘導后MKN28細胞經歷了EMT進程。為進一步闡明LMO1在TGF-β1調控MKN28細胞發生EMT轉移的作用，筆者采用RNA干擾技術下調LMO1表達，結果顯示，下調LMO1表達能夠明顯逆轉TGF-β1誘導的MKN28細胞出現EMT形態學變化，同時E-cadherin表達顯著回升，N-cadherin、MMP-9、VEGF表達顯著下降。以上結果充分證實LMO1在TGF-β1介導的信號轉導通路中可能發揮重要作用。

本研究結果顯示，TGF-β1可能通過某種信號通路上調其靶基因LMO1表達，從而明顯增強胃癌MKN28細胞的侵襲轉移能力，這可能是TGF-β1誘導MKN28細胞發生EMT和轉移的可能機制。本研究為深入探討胃癌發生、發展的分子機制及尋找治療胃癌的分子靶點提供了新思路。然而，TGF-β1調控LMO1表達的具體分子機制尚待后續研究。

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