CM-Dil標記示蹤間充質干細胞可行性的體外試驗*

陳小瑩，李欣然，王清，付霞霏

(南方醫科大學珠江醫院婦產科，廣州 510282)

干細胞是一類能自我增殖、具有多向分化潛能的細胞，由于其臨床應用的可行性及其生物學的重要特性，干細胞治療成為現代醫學研究領域的熱點[1]。間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有取材容易、可自身移植避免免疫排斥等優點,已被廣泛應用于組織工程和細胞治療的研究中[2]。而在深入進行細胞移植實驗前應對移植的 MSCs 進行標記以起到體內示蹤的作用。本試驗采用細胞膜熒光染料氯苯甲酰氨-1，1′雙十八烷基-3，3′，3′，3′-四甲基吲哚羰基花青高氯酸鹽(CM-Dil)標記大鼠骨髓間充質干細胞，并進行體外傳代培養，觀察其標記情況，為進一步利用MSCs進行移植研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1實驗動物 4周齡近交系SPF級Wistar雌性大鼠，體質量80 g,購自南方醫科大學實驗動物中心[許可證號：SYXK(粵)2011-0074]。

1.2材料 Wistar大鼠骨髓間充質干細胞及其完全培養基購自廣州賽業生物科技有限公司、 PBS 緩沖液購自Hyclone公司、胰蛋白酶購自 Gibco 公 司、 CM-Dil標記液購自Thermo Fisher Scientific公司、細胞計數Kit-8(CCK8)試劑盒購自日本Dojindo公司。

1.3方法

1.3.1骨髓間充質干細胞的分離培養 無菌條件下分離大鼠雙側股骨及脛骨，用剪刀從中間剪斷股骨及脛骨，用5 mL注射器抽取適量含 10%胎牛血清的專用培養基沖洗骨髓腔，將所得細胞懸液直接接種于T-25 cm2培養瓶中，細胞濃度約為1×109/L。置于37 ℃、5% CO2培養箱中常規培養。48 h后半量更換完全培養基。以后每2～3天全量更換新鮮培養基，待細胞融合約80%時可進行1∶2傳代，用0.25%胰酶消化，以5×104/cm2細胞濃度傳代擴增。用倒置顯微鏡觀察細胞形態，取第3代細胞用于以下試驗。

1.3.2骨髓間充質干細胞的鑒定 將貼壁細胞制成單細胞懸液,用流式細胞儀檢測細胞表面標記CD34、CD29、CD45、CD44。

1.3.3CM-Dil標記骨髓間充質干細胞 試驗分4組：MSC組、標記組1(1 μg/mL)、標記組2(2 μg/mL)、標記組3(4 μg/mL)。將細胞消化制成細胞濃度約為1×106/mL的細胞懸液，標記組1～3分別加入適量1 mg/L的 CM-Dil存儲液，使其最終濃度分別達1、2、4 μg/mL，隨后置于培養箱37 ℃下孵育30 min，1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，PBS沖洗2遍，用完全培養基重懸接種于培養瓶。

1.3.4CM-Dil標記率的觀察 標記完成后15 min繼續孵育24、48、72 h在熒光顯微鏡下觀察各組細胞形態并檢測骨髓間充質干細胞的CM-Dil陽性標記率，陽性標記率為隨機取10個非重疊視野(×100)，計算CM-Dil陽性細胞數占總細胞數的比例。細胞融合約80%時消化傳代培養，每次傳代后觀察細胞形態及標記率。

1.3.5CM-Dil標記細胞增殖能力檢測 細胞標記后直接以細胞濃度為1×104/mL接種于96孔板中，每組 35 孔細胞，每孔體積100 μL。每天08:00每組各取5孔細胞，加入 10 μL CCK8 孵育4 h后，用全自動酶標儀檢測490 nm吸光度(OD)值，連續7 d，并繪制生長曲線。

1.3.6CM-Dil標記細胞周期檢測 細胞標記后48 h制備成細胞懸液，利用PI-流式細胞儀技術檢測細胞周期。

2 結 果

2.1骨髓間充質干細胞培養 采用全骨髓貼壁法分離培養大鼠骨髓間充質干細胞，剛分離接種時細胞為圓形、橢圓形，接種24 h后在倒置顯微鏡下觀察發現,開始有少部分細胞貼附于瓶底。72 h后絕大部分細胞貼壁,呈梭形或多角形,呈集落樣生長。培養5～7 d后,細胞達80%融合,可進行細胞的首次傳代。傳代后細胞較原代略大，經4～5 d即可達80%融合。經傳3～4代后,細胞為長梭形,形態均一,排列有序(圖1)。

A：原代MSCs第3天(×100)；B：第3代MSCs(×100)

圖1原代及第3代大鼠骨髓間充質干細胞

2.2MSCs鑒定 經流式細胞儀檢測，90%以上細胞CD34和CD45表達陰性,CD44和CD29表達陽性。

2.3CM-Dil標記后細胞熒光表達情況及形態變化 CM-Dil濃度為1、2、4 μg/mL標記后15 min即見到紅色熒光(圖2)，標記率分別為(31.60±1.25)%、(88.73±1.79)%、(96.89±1.31)%。4 μg/mL組標記率明顯高于其他兩組，經ANOVA分析，3組間差異有統計學意義(F=1 757.21，P=0.000)。采用SNK法進行兩組間比較，1 μg/mL組與2、4 μg/mL組比較差異均具有統計學意義(P<0.05)，2 μg/mL組與4 μg/mL組比較差異也具有統計學意義(P<0.05)。而各組染色后24、48、72 h的細胞標記率進行組內比較則差異無統計學意義(P>0.05)。細胞標記后傳代至第6代時熒光表達仍較強，之后熒光強度開始衰減。標記的細胞在綠色熒光激發下呈現紅色熒光,且細胞形狀同未染色細胞大致相同。

A：懸浮MSC 4 μg/mL CM-Dil標記15 min(白光×100)； B：懸浮MSC 4 μg/mL CM-Dil標記15 min(熒光×100)；C：懸浮狀態4 μg/mL CM-Dil標記MSC第3代(白光×200)；D：懸浮狀態4 μg/mL CM-Dil標記MSC第3代(熒光×200)；E：貼壁4 μg/mL CM-Dil標記MSC第6代(熒光×100)；F：貼壁4 μg/mL CM-Dil標記MSC第8代(熒光×200)

圖2 MSC用CM-Dil標記后的熒光表達情況

2.4標記細胞增殖能力的檢測 4組MSCs的生長曲線如圖3所示。細胞增殖能力的檢測結果表明不同標記濃度組與未標記組的細胞生長趨勢相似，表明CM-Dil標記后 MSCs的增殖不受影響。

圖3 4組MSCs的生長曲線

2.5標記細胞細胞周期的檢測 由表1可見，4組間細胞周期G1期、S期及G2/M期百分比比較差異無統計學意義(F=1.665，P=0.251；F=1.317，P=0.335；F=2.159，P=0.171)，表明標記后細胞周期并沒有改變，無細胞增殖阻滯，提示CM-Dil對MSCs無細胞毒性。

表1 4組細胞細胞周期比較%)

*:P>0.05,與MSC組比較

3 討 論

骨髓間充質干細胞是一種成體干細胞，具有多向分化的潛能，在特定環境下可分化為神經系統細胞、成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等，其應用前景不可估量。目前骨髓間充質干細胞的分離培養方法主要有：全骨髓貼壁分離法、密度梯度離心分離法等[3-4]。本試驗采用全骨髓貼壁分離法成功分離大鼠骨髓間充質干細胞。全骨髓貼壁法不僅根據不同細胞的貼壁性來去除雜質細胞,而且還通過不同細胞所需的消化時間不同來達到純化骨髓間充質干細胞的目的[5]。利用造血系細胞懸浮生長，而骨髓間充質干細胞貼壁生長的特性，每次換液去除造血系細胞；再根據骨髓間充質干細胞較成纖維細胞易脫落的特點，傳代時嚴格掌握消化酶的量和消化時間，待細胞稍見回縮即終止消化，這樣不僅能使骨髓間充質干細胞得到進一步純化，還能保持細胞的活性。經數次傳代，可獲得平行狀或輻射狀的形態均一的梭形骨髓間充質干細胞。經流式細胞儀鑒定證實全骨髓貼壁法獲得的大鼠骨髓間充質干細胞純化程度高，且增殖能力活躍，具有骨髓間充質干細胞的一般生物學特性。

細胞標記在干細胞移植及分化研究中是必不可少的環節。這就需要一種盡可能操作簡便、技術可靠、結果可信、便于檢測的細胞標記示蹤技術。至今為止已有多種細胞標記示蹤方法，包括綠色熒光蛋白、5-溴脫氧尿嘧啶核苷、細胞膜或核染料等[6-8]，它們各有優缺點。綠色熒光蛋白標記穩定性強，是目前被較為廣泛接受的標記方法，但其標記程序復雜繁瑣，而且延長組織固定時間熒光信號會受影響[9]；4,6-聯咪-2-苯基吲哚(DAPI)標記時間短，且標記后細胞停止增殖，不適合體內試驗[10]；而5-溴脫氧尿嘧啶核苷的移植細胞死亡后，其中的BrdU將會釋放出來，并被鄰近細胞攝取而導致出現假陽性[11]。

CM-Dil是一種親脂性羰花青熒光膜染料，是目前較好的熒光染料。目前可用的親脂性羰花青，包括Dil和Dio，PKH2及PKH26染料，在標記懸浮細胞過程中有時需要滲透壓調節劑或去鹽來避免在標記過程中形成染料沉淀。此外，Dil標記不能在常規組織固定過程中兼容而進行長期保存。與Dil不同，CM-Dil的CM基團能與多肽及蛋白上的巰基反應從而使該分子在醛類物質中保持穩定，因此標記后進行固定、脫水及石蠟包埋等操作并不影響其熒光效果。CM-Dil可在綠色熒光激發下，發射出波長為570 nm的紅色熒光。本研究對CM-Dil標記后細胞進行顯微鏡下形態觀察，發現標記后細胞與未標記細胞的形態無明顯異常。另外，CM-Dil標記后細胞生長曲線的分析說明CM-Dil標記后細胞的增殖不受影響，而且細胞周期檢測結果表明細胞標記后無細胞阻滯。研究結果提示低濃度CM-Dil對細胞沒有毒性作用，與馬慧雨等[12]的研究結果一致。此外，張雅妮等[13]的研究還顯示，CM-Dil標記后對大鼠骨髓間充質干細胞的遷移能力并無明顯影響。本試驗通過比較不同濃度CM-Dil對MSCs的標記率，發現4 μg/mL CM-Dil濃度具有較高的標記率，標記率可達96%以上。標記后15 min在熒光顯微鏡下即可看到很強的熒光表達。傳至第6代時熒光表達仍較強，之后熒光強度開始減弱。熒光強度衰減可能與操作過程中未能完全避光、細胞分裂膜染料減少等有關。

綜上所述，本試驗通過全骨髓貼壁法獲得較高純度、生物學特征穩定的大鼠骨髓間充質干細胞。全骨髓貼壁法分離培養骨髓間充質干細胞方法簡單，成功率高，可作為分離、培養人類骨髓間充質干細胞的可借鑒方法之一，為日后臨床應用骨髓間充質干細胞移植治療疾病提供實驗基礎。利用4 μg/mL CM-Dil標記細胞，標記率高，方法簡單可靠，熒光淬滅時間較長，檢測方法簡便，可直接在熒光顯微鏡下觀察。CM-Dil標記作為一種高效穩定、用于一定時期內追蹤間充質干細胞的標記方法，可用于追蹤間充質干細胞體內移植后能否在靶器官定植及分化，在組織工程中有較好的應用前景。

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