甲狀腺乳頭狀癌中PRL-3表達與腫瘤相關巨噬細胞及淋巴管生成的相關性

孫振華 蔣華平 陶文華

江蘇大學附屬醫院1甲乳外科，2頭頸外科，3中醫腫瘤科（江蘇鎮江212000）

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲狀腺疾病中最常見的惡性腫瘤類型，其發病率近年來有上升的趨勢，早期易發生淋巴結的轉移［1-3］。研究［4-5］表明，腫瘤微環境中的基質細胞在甲狀腺癌發生發展和侵襲轉移的進程中發揮了重要的作用，微環境中腫瘤相關巨噬細胞（tumor associated macrophags，TAMs）中可以有表型的變化，產生促使腫瘤生長的能力。而肝再生磷酸酶3（phosphatase of regenerating liver-3，PRL-3）作為具有促進細胞增殖、遷移和侵襲的蛋白酪氨酸磷酸酶，在PTC中高表達，且與腫瘤大小及淋巴結轉移相關［6-8］。本研究擬檢測PTC中PRL-3、TAMs標志物CD68和淋巴管內皮標記物D2-40的表達，分析PRL-3表達與TAMs及淋巴管生成的相關性。

1 資料與方法

1.1 標本收集江蘇大學附屬醫院甲乳外科2014年1月至2017年6月部分PTC手術切除病理標本70例，其中男24例，女46例；年齡22～68歲，中位年齡46.5歲；有頸部淋巴結轉移39例，無淋巴結轉移31例。另取20例甲狀腺腺瘤組織作為良性疾病對照組。

1.2 試劑及方法PRL-3、CD68和D2-40蛋白表達用SP免疫組織化學法檢測。免抗人PRL-3多克隆抗體購自英國Abcam公司，鼠抗人CD68單克隆抗體、鼠抗人D2-40單克隆抗體及SP試劑盒均購自北京中杉公司。陽性對照使用已知陽性切片，陰性對照用PBS代替一抗，按試劑盒說明書進行檢測。

1.3 切片免疫組化結果根據陽性細胞百分比及染色強度評分判定，依照陽性細胞比例：＜5%、5%～25%、25%～50%、50%～75%、＞75%分別得0分、1分、2分、3分、4分；依照顯色強度：未著色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別得0分、1分、2分、3分；將兩項得分相乘得到該視野的最終得分，選取的5個視野得分的平均值為最后得分。最后該切片按照得分為以下四個等級：0～1分為（-），2～4分為（+），5～7分（++），≥8分（+++），++以上為陽性表達［9-10］。D2-40標記的淋巴管數目計數參照Weidner標準。低倍鏡（×40）下選取密度較高淋巴管區域，然后在高倍鏡（×200）下5個高倍視野計數被染色的淋巴管數，染成棕色的內皮細胞或內皮細胞簇計為一個淋巴管，取其平均值作為淋巴管密度（LVD）［11］。

1.4 統計學方法應用SPSS 22.0軟件進行統計分析。計數資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為統計學有差異。相關性采用Spearman等級相關分析，連續變量采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 PRL-3、CD68和D2-40在PTC及甲狀腺腺瘤中的表達PRL-3陽性表達定位于腫瘤細胞的細胞漿和細胞膜，PTC、甲狀腺腺瘤中PRL-3蛋白的陽性表達率分別為64.3%和15.0%，二組相比差異有統計學意義（P＜0.01）；CD68陽性表達定位于TAMs的細胞漿和細胞膜，主要是細胞漿。PTC中TAMs的密度高于甲狀腺腺瘤中的密度（P＜0.01）；D2-40在PTC組織中的表達水平高于在甲狀腺腺瘤組織中的表達水平（P＜0.01）。見表1。

表1 PRL-3、CD68和D2-40蛋白表達的比較Tab.1 Comparison of each protein expression between the two groups of specimens

2.2 PRL-3、CD68和D2-40表達與PTC病理特征的關系PTC組織中，PRL-3、CD68和D2-40的表達水平與患者年齡、性別及腫瘤大小無關（P＞0.05），但與淋巴結有無轉移相關（P＜0.01）（表2，圖1）。Spearman相關性分析表明，PRL-3、CD68和D2-40三者表達水平呈現正相關性（P＜0.05）（表3）。

表2 PRL-3、CD68及D2-40與PTC臨床病理特征的關系Tab.2 The relations of each protein expression with the clinicopathologic variables of papillary thyroid carcinoma patients

圖1 免疫組化（SP法）檢測PRL-3、CD68及D2-40蛋白的表達（×200）Fig.1 Immunohistochemical staining for PRL-3（A），CD68（B）and D2-40（C）expressions（×200）

表3 PRL-3、CD68及D2-40在甲狀腺乳頭狀癌中表達的相關性Tabl.3 The correlation among three proteins in papillary thyroid carcinoma

3 討論

PTC是甲狀腺疾病中最常見的腫瘤類型，其發病率近年來呈現上升趨勢，早期易發生區域性淋巴結轉移。而PRL-3是PRLs基因家族成員之一，是新近發現的蛋白酪氨酸磷酸酶家族成員，其分子結構體現了雙重特異性磷酸酶的典型特征［12-13］。目前已經證明某些惡性腫瘤發生發展與PRL-3關系密切，其作為靶點在腫瘤治療中的潛力已經體現，但PRL-3在PTC侵襲轉移中的作用及其分子機制未得到充分研究［14-16］。關于PRL-3誘導PTC微環境中巨噬細胞的募集和分化、促進PTC淋巴轉移、腫瘤侵襲的分子機制尚未見報道。本研究檢測PTC中的PRL-3、TAMs標記物CD68和淋巴管內皮標記物D2-40的表達，并對性別、年齡、淋巴結轉移、腫瘤大小病理學特征進行分析，探討PRL-3在PTC發生、發展中的作用。

PRL-3基因在腫瘤進展中的作用具有多效性，Al-Aidaroos等在多種人腫瘤細胞系中發現了PRL-3誘導表皮生長因子受體（EGFR）的過度激活和級聯放大的下游信號［17］。本研究發現，PTC組中PRL-3表達的陽性率為64.3%，高于其在甲狀腺腺瘤組中的陽性率15.0%（P＜0.05），提示PRL-3可能參與甲狀腺乳頭狀癌的發生過程。對于PTC而言，PRL-3在淋巴結轉移組中的陽性率為79.5%，高于其在無淋巴結轉移組中的陽性率45.2%，差異有統計學意義（P＜0.01）；而其在性別、年齡、腫瘤大小分組中的表達水平無明顯差異（P＞0.05）。Spearman相關性分析后表明，PRL-3的表達與CD68、D2-40的表達水平呈正相關性（P＜0.05）。以上結果說明PRL-3的高表達可以促進TAMs的增殖和淋巴管生長，在PTC腫瘤的進展演進及淋巴轉移過程中發揮了重要的作用。

PTC最主要的轉移方式是頸部淋巴結轉移，約70%的患者發病時就可能合并區域性淋巴結轉移。研究證實，TAMs主要是通過自分泌和（或）旁分泌途徑參與腫瘤淋巴管的生成［18］。研究腫瘤發生發展過程中的TAMs的功能狀態具有重要意義，而CD68是目前研究TAMs的特異性標志物，檢測其表達水平可以了解TAMs的功能狀態［19-20］。本研究表明，CD68在PTC組中的陽性表達（71.8%）高于甲狀腺腺瘤組（20.0%），差異有統計學意義（P＜0.01）；而在PTC組中，CD68陽性表達與年齡、性別及腫瘤大小無關（P＞0.05），但是其在淋巴結轉移組中的陽性率（87.2%）高于無淋巴結轉移組（54.8%），差異有統計學意義（P＜0.01）；Spearman相關分析結果表明，CD68與D2-40的表達水平呈正相關，說明了TAMs不僅在PTC發生發展中起作用，而且也參與了腫瘤淋巴轉移的過程，其也可能作為甲狀腺乳頭狀癌的預后參考指標。

某些具有轉移特性或血管侵襲性的腫瘤組織內部淋巴管密度增加，這說明腫瘤內部淋巴管既關系到腫瘤的局部復發、淋巴結轉移及預后，還可能參與了腫瘤細胞的惡性演進［21］。D2-40的特點是可以特異性的標記淋巴管，血管卻不被標記，因此可以準確的檢測組織淋巴管的密度［22］。本研究發現LVD在PTC組中的水平（11.26±5.12）高于甲狀腺腺瘤組（3.78±2.13），差異有統計學意義（P＜0.01）；而LVD密度在PTC組中與性別、年齡及腫瘤大小無關，與淋巴結轉移相關，表明PTC腫瘤組織中淋巴管的數量與腫瘤的淋巴結轉移密切相關。而淋巴管在數量上的增加，將會使腫瘤細胞進一步沿淋巴管的播散成為可能，這也是甲狀腺乳頭狀癌容易發生淋巴轉移的原因。

綜上所述，PRL-3在PTC中高表達，其表達水平與CD68、D2-40呈正相關性，三者在PTC的發生發展以及淋巴結轉移進程中發揮了重要的作用，而其中的分子機制有待進一步揭示。

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