5-羥色胺轉運體基因啟動子區單核苷酸多態性與結直腸癌化療致惡心嘔吐的易感性

魏宜勝 周亞光 王綺雯 張嘯 羅敏睿

廣州醫科大學附屬第二醫院胃腸外科，外科實驗室（廣州510260）

結直腸癌目前在國內外發病率不斷上升［1-3］，一直位于各種惡性腫瘤發生率前列［4］。化療是控制結直腸癌進展的重要手段，術后輔助化療可消除微小轉移灶，降低腫瘤復發轉移率、提高生存率［5］，但也引起了惡心嘔吐、肝腎損害、神經毒性、骨髓抑制等毒副作用［6］。化療致惡心嘔吐（chemotherapy-induced nausea and vomiting，CINV）是常見的早期化療毒性反應［7-8］，削弱患者對化療藥物的耐受性，限制了化療臨床應用。但不同人群發生CINV也各不相同，顯示了藥物反應的遺傳易感性在CINV中起到關鍵作用。但目前尚缺乏中國人群結直腸癌CINV的藥物遺傳易感性研究；并且國外關于CINV遺傳易感性報道僅限于化療藥物代謝過程的相關基因，而藥物反應的差異涉及到轉運、分布、代謝、轉化各個環節，僅代謝過程相關基因遺傳變異不足以完全解釋結直腸癌CINV個體化差異。目前認為惡心嘔吐反應與5-羥色胺有關，而 5-羥色胺轉運體（serotonin transporter，SERT）可將相應部位的5-羥色胺迅速攝取從而終止其作用，但是目前SERT引起結直腸癌CINV的藥物基因組學研究尚未見報道。筆者進一步檢索 Genbank數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov），發現SERT啟動子區存在單核苷酸多態性位點rs956304A→G變異，并通過啟動子檢索工具TFSEARCH（http：//mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.ht mL）發現rs956304位點變異存在轉錄因子的改變。因此，本研究擬研究中國人群SERT啟動子位點rs956304A→G多態性與結直腸癌CINV的遺傳易感性，分析中國人群SERT啟動子多態位點與結直腸癌CINV的關聯，揭示中國結直腸癌人群CINV分子流行病學特征，為結直腸癌化療個體化用藥提供新的生物學標記，為防治中國人群結直腸癌CINV提供新的理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集廣州醫科大學附屬第二醫院胃腸外科2009年9月至2014年4月期間結直腸癌術后化療患者166例。所有入組病例均接受mFOLFOX6方案化療，并滿足以下標準：（1）期望生存 ≥ 3個月；（2）心肺肝腎功能良好；（3）化療前血象、生化指標基本正常；（4）化療前未經相關放療及生物靶向治療；（5）細胞學或組織學診斷為結直腸癌；（6）行手術切除并有術后病理診斷；（7）術后隨訪資料完整。排除標準：未行手術者；無明確術后病理診斷者；術后未化療患者；肛管癌患者；家族性息肉病惡變患者。

1.2 結直腸癌CINV評估采用美國國立癌癥研究 所（National Cancer Institute，NCI）分 級 標 準（Common Ter minology Criteria for Adverse Events Version 4.0，CTCAE-4.0），見表1。統一培訓調查員進行評估。以0～1級結直腸癌CINV為參照（即無或輕度CINV），2～5級為中重度CINV。

表1 結直腸癌CINV不良反應分級參考標準Tab.1 Reference standards of colorectal CINV grade

1.3 實驗所用材料主要試劑：2xTaq PCR Green Mix（含有TaqDNA聚合酶，dNTPs，Taq酶反應緩沖液、穩定劑和染料）購買于北京鼎國昌盛生物技術公司，引物由華大基因生物公司合成。上游引物：5′-AGGGGTCAGTTCCTCCAAGT-3′；下游引物：5′-AATTCCTCTCCGTCCCCAGA-3′，擴增長度為662 bp。

1.4 實驗方法所有入組病例外周血標本進行以下操作：提取總DNA、PCR擴增、PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，擴增產物測序。 具體如下：（1）模板DNA提取：肝素抗凝管抽取外周靜脈血4 mL，用天根外周血DNA提取試劑盒提取白細胞總DNA，放-80℃冰箱保存備用。（2）PCR 擴增目的基因：采用多聚酶鏈反應（PCR）擴增目的DNA，PCR 反應總體系20 μL，成份有10 μL 2×Taq PCR Green Mix（含有 0.1 U/μL Taq DNA polymerase，0.4 mmol/L dNTPs，2×反應緩沖液、3 mmol/L MgCl2）、上游引物 2 μL（10 μmol/L），下游引物 2 μL（10 μmol/L），4 μL ddH2O，2 μL DNA模板。PCR擴增程序為：95℃預變性3 min，循環1次；95℃變性30 s，55℃變性30 s，72℃延伸1 min，循環35次；72℃最終延伸10 min，循環1次，4℃終延伸無窮大。PCR產物保存于-20℃。（3）PCR擴增產物電泳：PCR擴增產物經1.7%瓊脂糖凝膠電泳，用DNA Maker DL1000作為參照物比對，恒壓90 V，時間45 min。將已跑完電泳的凝膠放入含有gel red染料的染液中染色30 min，接著置于熒光/可見光成像分析系統（BIO-RAD公司）下觀察，圖像分析可檢測到基因片段為662 bp。（4）基因型測序：將所得PCR擴增產物進行序列分析，測序結果與Pubmed查閱對應的位點基因序列相一致。結果為rs956304基因多態性位點分析擴增產物為3種基因型AA型（圖1）、AG型（圖2）、GG型（圖3）。圖中箭頭所指為多態性位點，雙峰為雜合子，單峰為純合子。

1.5 數據收集收集入組病例的性別、年齡、身高、體重、分化程度、分期、文化程度、腫瘤部位等臨床病理資料以及位點rs956304基因型。

1.6 數據處理采用統計學軟件SPSS 19.0進行數據分析，P＜0.05為差異有統計學意義。采用吻合度χ2檢驗分析本研究人群rs956304基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg（H-W）遺傳平衡定律，吻合度用Arlequin3.0軟件處理。卡方檢驗單因素分析臨床病理因素以及rs956304基因型與中到重度CINV的關聯。Logistic多因素風險模型分析各臨床病理因素及位點rs956304基因型對中到重度CINV的獨立影響。

圖1 rs956304 AA基因型Fig.1 rs956304 AA genotype

圖2 rs956304 AG基因型Fig.2 rs956304 AG genotype

圖3 rs956304 GG基因型Fig.3 rs956304 GG genotype

2 結果

2.1 研究對象的一般特征入選病例組有166例，其中男99例，女67例，年齡25～85歲，中位年齡為63歲，包括結腸癌92例（55.4%）、直腸癌74例（44.6%）。

2.2 遺傳平衡吻合度檢驗研究對象基因型符合H-W遺傳平衡定律（χ2=0.115 6336 8，P=0.733 82），說明樣本基因遺傳平衡，數據來自同一蒙德爾群體。

2.3 結直腸癌CINV關聯分析的單因素檢驗單因素卡方檢驗結果示中到重度CINV與性別、年齡、體重指數（body mass index，BMI）、分化程度、分期、文化程度及腫瘤部位無統計學意義（P＞0.05），但中到重度CINV與位點rs956304基因型明顯相關，AG+GG基因型更易發生中到重度CINV（P=0.011）。見表2。

表2 結直腸癌患者CINV的單因素分析Tab.2 Univariate analysis of colorectal CINV 例（%）

2.4 Logistic多因素回歸分析進一步把性別、年齡、BMI、分化程度、分期、文化程度、腫瘤部位及rs956304基因型納入Logistic回歸模型。結果顯示rs956304基因型依然與化療致惡心嘔吐相關，AG+GG型基因組患者相比AA型基因組的患者發生中到重度CINV的風險明顯增高（OR=3.215，95%CI：1.202 ～ 8.599，P=0.020）。見表3。

表3 影響結直腸癌患者CINV的多因素回歸分析Tab.3 MultivariatelogisticregressionanalysisofcolorectalCINV

3 討論

化療是結直腸癌的重要治療手段，研究表明結直腸癌患者CINV的發生率為83.3%［9］，但臨床一般僅給予對癥處理，較少引起特別關注。本研究開創性地揭示了rs956304 AG+GG基因型患者更易發生中重度CINV，rs956304 AG+GG基因型是發生結直腸癌中重度CINV的獨立危險因素，首次揭示了SERT基因啟動子常見變異發生結直腸癌中重度CINV的遺傳易感性。

有研究［10］認為引起CINV的主要機制可能與化療藥物刺激消化道黏膜的嗜鉻細胞釋放5-羥色胺有關，5-羥色胺與受體結合產生神經沖動并傳入嘔吐中樞導致嘔吐［11-12］。5-羥色胺是一種與胃腸道活動關系密切的腦腸肽，廣泛存在于中樞神經系統和胃腸道的神經遞質，具有多種生物學功能［13-14］。5-羥色胺信號系統異常可導致胃腸動力及分泌功能異常、內臟高敏感性等病理生理改變。在病理狀態下，5-羥色胺和其他炎癥因子一起，促進腸道分泌及動力改變，引起惡心、嘔吐及疼痛等反應［15］。5-羥色胺的再攝取由SERT跨膜轉運蛋白介導，該蛋白對5-羥色胺有高度親和力，它可將相應部位的5-羥色胺迅速攝取從而終止其作用［16］。

由于SERT通過滅活5-羥色胺從而在結直腸癌CINV中有重要意義，而SERT啟動子轉錄活性決定了其表達水平［17］，因此研究SERT啟動子發生CINV的遺傳易感性也有重要意義。筆者也通過啟動子預測工具檢索發現，當rs956304位點等位基因為野生型A時，可結合轉錄因子A ML-1a、deltaE；rs956304位點等位基因為變異型G時，沒有轉錄因子。因此，由于rs956304單核苷酸多態性遺傳變異引起轉錄因子的改變，從而改變了SERT基因啟動子的活性，影響了SERT表達水平和5-羥色胺的再攝取，最終影響了結直腸癌CINV的易感性。

目前關于結直腸癌CINV的遺傳易感性亦有報道。楊牡丹等［18］研究了國內159例結直腸癌患者，認為XRCC1基因第399位密碼子多態性與結直腸癌CINV有關，發現XRCC1 AA或AG基因型的結直腸癌患者CINV的發生率明顯高于GG基因型。曹家燕等［19］研究了國內212例頭頸部惡性腫瘤，結果212例患者化療后出現惡心嘔吐131例，出現惡心嘔吐與位點rs3758987有關，認為HTR3B基因rs3758987位點與頭頸部惡性腫瘤患者化療后出現惡心嘔吐有關，發現CC、CT基因型者化療后出現惡心嘔吐的風險明顯高于TT基因型者。但是，這些報道僅限于化療藥物代謝、轉化過程中的相關基因，對于直接作用于惡性嘔吐信號系統的基因尚未見報道。本研究首次報道作用于5-羥色胺的SERT基因遺傳易感性。

但是，本研究人群樣待證實。并且，本研究人群樣本例數雖然達到統計學要求，但由于是單中心研本主要來自中國南方人群，中國其他地區人群、國外不同種族人群是否也有同樣的遺傳易感性尚有究，仍不免產生統計偏倚，本研究結論尚需更大樣本量、多中心研究證實。

總之，本研究首次揭示了中國南方人群SERT啟動子位點rs956304 AG+GG基因型發生結直腸癌CINV的遺傳易感性，為防治中國南方人群結直腸癌CINV提供新的生物標記，為結直腸癌化療個體化合理用藥提供了理論依據。

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