酪酸梭菌對膽汁淤積大鼠的腸黏膜通透性和緊密連接蛋白的影響

馬姝麗 李小芹 王菊平

鄭州兒童醫院，鄭州大學附屬兒童醫院 1藥學部，2消化內科（鄭州450018）

肝內膽汁淤積癥是由肝細胞和（或）毛細膽管膽汁排泌障礙引起的以膽汁流出部分或完全阻滯為特征的綜合征，其癥狀主要為黃疸、肝功能異常、皮膚瘙癢等［1］，其發病率在出生嬰兒約為1/2 500［2］。膽汁淤積時排進腸道內的膽汁減少，導致腸上皮細胞間緊密連接的斷裂及表達的改變，腸黏膜屏障受損，導致腸道功能紊亂、腸源性感染。腸黏膜屏障受損時，大量細菌和內毒素從腸道經門靜脈進入肝臟，激活肝內固有的巨噬細胞，分泌一系列細胞因子產生炎癥級聯反應，引起或加重肝損傷。肝與腸道間的相互作用，為膽汁淤積相關疾病的防治提供了新的切入點。酪酸梭菌是一種益生菌，能夠促進腸道內菌群生態平衡，改善腸黏膜屏障，用于腸道菌群紊亂引起的急慢性腹瀉和消化不良。臨床研究表明酪酸梭菌能降低體內膽紅素的水平［3］，可用于治療新生兒高膽紅素血癥及膽汁淤積，但其具體作用機制仍不明確。本研究通過膽汁淤積大鼠模型，檢測分析酪酸梭菌對大鼠血清生化指標的影響，觀察肝組織病理學和小腸組織緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的表達變化，評價酪酸梭菌對膽汁淤積大鼠的腸黏膜通透性和緊密連接蛋白的的作用，探討酪酸梭菌治療膽汁淤積的內在機制，為臨床治療相關疾病提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料酪酸梭菌（青島東海藥業有限公司）；α-荼基異硫氰酸鹽（ANIT）溶液（美國Sigma公司）；丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、血清總膽紅素（T-BIL）、二胺氧化酶（DAO）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；緊密連接蛋白（Occludin）、閉鎖小帶蛋白-1（ZO-1）多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）。

1.2 模型制備與給藥40只雄性SD大鼠，鼠齡8周（河南省實驗動物中心提供），隨機分為正常（Con）組、模型（Mod）組、酪酸梭菌低（CBL，4.0×106CFU/kg）、高劑量（CBH，8.0× 106CFU/kg）組，每組大鼠10只。除正常組外，其余各組大鼠均按50 mg/kg灌胃ANIT橄欖油溶液制備大鼠肝內膽汁淤積模型［4］，并于造模次日開始灌胃相應藥物，正常組和模型組灌胃蒸餾水，每天1次，連續5 d。

1.3 血清指標測定末次給藥后禁食12 h，大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，離心分離血清，按照試劑盒說明檢測血清中ALT、AST、DAO的活性和T-BIL含量。

1.4 組織病理檢測采血后取大鼠肝臟固定部位經甲醛固定，常規石蠟包埋，切片，常規HE染色，于顯微鏡下觀察肝組織病理學形態。

1.5 Werstern blotting檢測采血后分離小腸組織，取100 mg小腸組織提取蛋白，BCA法測定蛋白含量，取適量蛋白樣品變性，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將蛋白轉移至PVDF膜上，奶粉封閉，漂洗后加Occludin一抗（1∶800）或ZO-1一抗（1∶500）4℃過夜，漂洗后以辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h，漂洗后ECL曝光成像，用Image-Pro Plus 6.0軟件分析，以目的蛋白的積分光密度/內參β-actin的積分光密度的比值作為蛋白的表達量

1.6 統計學方法采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清指標結果與Con組比較，Mod組大鼠血清中各項指標水平明顯升高（P＜0.05）。與Mod組比較，CBL組、CBH組大鼠血清ALT、AST、DAO活性明顯降低，T-BIL含量明顯減少（P＜0.05），且酪酸梭菌各劑量組大鼠血清中生化指標水平隨著酪酸梭菌劑量的增加而減少。見表1。

表1 大鼠血清中ALT、AST、T-BIL和DAO的含量Tab.1 The contents of ALT,AST,T-BIL and DAO in serum（n=10） ±s

表1 大鼠血清中ALT、AST、T-BIL和DAO的含量Tab.1 The contents of ALT,AST,T-BIL and DAO in serum（n=10） ±s

注：與Con組相比，*P＜0.05；與Mod組相比，▲P＜0.05

2.2 肝組織病理結果HE染色后光鏡下觀察，Con組肝臟肝小葉結構清晰，肝索由中央靜脈向四周呈放射狀排列，肝細胞無變性壞死和淋巴細胞浸潤；Mod組大鼠肝組織的匯管區可見大量炎性細胞浸潤，膽管上皮細胞增生，管腔狹窄，肝小葉結構不清；CBL組、CBH組大鼠肝組織炎性細胞明顯減少，膽管上皮細胞增生減輕，管腔相對狹窄，病理較Mod組有所改善。見圖1。

2.3 Werstern blotting結果與Con組比較，Mod組大鼠小腸組織中Occludin、ZO-1蛋白表達減少（P＜0.05）。與Mod組比較，CBL組、CBH組大鼠小腸組織中Occludin、ZO-1表達顯著增加（P＜0.05）。見圖2、表2。

3 討論

自從馬歇爾提出了“肝腸軸”的概念，肝臟疾病與腸道的作用就逐漸受到關注。機體腸道與肝臟間存在交互作用，如果腸道黏膜屏障功能受損，致使腸道黏膜的通透性發生改變，腸道內細菌和內毒素移位進入門靜脈系統，機體產生一系列的炎癥反應和免疫應答，可進一步造成腸道黏膜及遠隔器官損傷。膽汁淤積時腸道內膽汁減少，導致腸上皮細胞間緊密連接的斷裂及表達的改變，腸黏膜屏障受損，通透性增加。由于肝腸軸的存在，肝臟與腸道之間存在的相互作用為膽汁淤積相關疾病的防治提供了新的切入點，保護腸黏膜屏障可能是治療肝臟相關疾病的開創性治療方法［5］，本研究試圖從益生菌調節腸黏膜緊密連接，保護腸黏膜屏障進而改善肝臟病理變化，探討益生菌防治膽汁淤積及相關疾病的作用機制。

圖1 各組大鼠的肝組織病理（HE，×200）Fig.1 Pathomorphology of liver tissues in rats(HE staining,×200)

圖2 Westernblotting大鼠小腸組織中Occludin和ZO-1的表達Fig.2 The expression of Occludin and ZO-1 proteins in small intestines

表2 大鼠小腸組織中Occludin和ZO-1的蛋白表達Tab.2 The expression of Occludin and ZO-1 in small intestines（n=10） x ± s

α-荼基異硫氰酸鹽誘發大鼠膽汁淤積在病理上主要表現為肝實質細胞和膽管上皮細胞損傷，造成膽管阻塞引起膽汁淤積，與人類肝內膽汁淤積性肝病極為相似，因此常被用來復制膽汁淤積型肝炎動物模型［6］。本研究用α-荼基異硫氰酸鹽灌胃大鼠復制模型，大鼠血清中的ALT、AST和TBIL較正常組大鼠明顯升高，且模型大鼠肝組織病理切片可見膽管上皮細胞的增生、壞死，大量炎性細胞浸潤，表明本實驗建立大鼠膽汁淤積模型成功。

益生菌可改善腸道內微生物菌群的平衡，加速損傷腸黏膜的修復［7］，此外，益生菌還可通過增加緊密連接蛋白的表達以加固腸黏膜物理屏障［8］。DAO存在于腸黏膜上層絨毛細胞胞漿中具有高度活性的內酶，當腸黏膜細胞受損后DAO進入腸淋巴管和血液，導致血液中DAO活性增高，DAO是反映小腸黏膜結構功能較為敏感的指標［9-10］。腸黏膜屏障包括機械屏障、化學屏障、免疫屏障和生物屏障，機械屏障是非常重要的組成部分。完整的機械屏障由腸上皮、上皮細胞間緊密連接及上皮間質構成。緊密連接表達的改變可能是膽汁淤積時腸黏膜屏障損傷、通透性增加的重要的原因［11］。Occludin和ZO-1是上皮細胞間緊密連接結構的主要蛋白分子，Occludin通過胞膜外部分與相鄰細胞發生結合而產生細胞旁封閉，ZO-1則在連接Occludin中起橋梁作用ZO-1起著裝配平臺作用，同時又是Occludin與胞內骨架系統連接及信號轉導機制中的重要結構，對腸上皮起穩定作用［12］。本研究發現膽汁淤積大鼠的血清中DAO活性較正常大鼠明顯升高，小腸中緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的蛋白表達明顯減少，表明膽汁淤積大鼠的腸黏膜屏障受到損傷，結構受到破壞，緊密連接表達減少。酪酸梭菌可降低膽汁淤積大鼠血清中DAO的活性，增加小腸中緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的蛋白表達，說明酪酸梭菌可改善大鼠腸黏膜通透性，對腸黏膜屏障具有保護作用。

腸道菌群不僅在人體消化吸收、免疫應答等活動中發揮作用，其還作為肝-腸循環的重要媒介，與非酒精性脂肪性肝病、膽汁淤積、肝硬化、肝性腦病等密切相關［13］，直接或間接影響肝臟的功能。多項研究從益生菌改善腸道菌群、腸道屏障功能等機制方面證實［14-15］，益生菌確有改善患者肝臟功能的作用。本研究顯示酪酸梭菌可降低膽汁淤積大鼠血清中ALT、AST的活性和T-BIL的含量，改善肝組織病理，表明酪酸梭菌具有改善膽汁淤積大鼠肝損傷的作用。

本研究創新之處為基于肝腸軸應用酪酸梭菌治療膽汁淤積造成的肝損傷，并從腸黏膜通透性和緊密連接表達探索其作用機制，研究表明酪酸梭菌改善肝損傷的作用可能與其調節腸黏膜通透性、增加緊密連接蛋白表達有關，然而肝腸之間相互作用的途徑復雜，酪酸梭菌是否也通過其他機制起到保護肝損傷的作用仍需進一步的研究。

［1］周建利，周少明，程勇衛，等.嬰兒膽汁淤積性黃疸的病因、臨床特點及轉歸分析［J］.實用醫學雜志，2016，32（13）：2172-2174.

［2］FISCHLER B，LAMIREAU T.Cholestasis in the newborn and infant［J］.Clin Res Hepatol Gastroenterol，2014，38（3）：263-267.

［3］王曉玲，王江濤.更昔洛韋、酪酸梭菌聯合使用對巨細胞病毒感染引起嬰兒淤膽型肝炎綜合征的治療效果觀察［J］.北方藥學，2017，14（6）：34-35.

［4］CULLEN J M，FAIOLA B，MELICH D H，et al.Acute alpha-Naphthylisothiocyanate induced liver toxicity in germfree and conventional male rats［J］.Toxicol Pathol，2016 ，44（7）：987-997.

［5］張真玲，段志軍.腸肝軸-肝病防治中的重要目標［J］.世界華人消化雜志，2016，24（23）：3454-3460.

［6］GOLBAR H M，IZAWA T，ICHIKAWA C，et al.Slowly progressive cholangiofibrosis induced in rats by α-naphthylisothiocyanate（ANIT），with particular references to characteristics of macrophages and myofibroblasts［J］.Exp Toxicol Pathol，2013，65（6）：825-835.

［7］EVERARD A，BELZER C，GEURTS L，et al.Cross-talk between akkermansia muciniphila and intestinal epithelium controlsdiet-induced obesity［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2013，110（22）：9066-9071.

［8］DAI C，ZHAO D H，JIANG M.VSL#3 probiotics regulate the intestinal epithelial barrier in vivo and in vitro viathe p38 and ERK signaling pathways［J］.Int J Mol Med，2012，29（2）：202-208.

［9］LI H，QIU P，WANG J，et al.Effects of compound Ginkgo biloba on intestinal permeability in rats with alcohol-induced liver injury［J］.Food Funct，2015，6（2）：470-478.

［10］SUN T，GAO G Z，LI R F，et al.Bone marrow-derived mesenchymal stem cell transplantation amelioratesoxidative stress and restores intestinal mucosal permeability in chemically induced colitis in mice［J］.Am J Transl Res，2015，7（5）：891-901.

［11］YIN J，WU M，DUAN J，et al.Pyrrolidine dithiocarbamate inhibits NF-KappaB activation and upregulates the expression of Gpx1，Gpx4，Occludin，and ZO-1 in DSS-induced colitis［J］.Appl Biochem Biotechnol，2015，177（8）：1716-1728.

［12］YU T，LU X J，LI J Y，et al.Overexpression of miR-429 impairs intestinal barrier function in diabetic mice by down-regulating occludin expression［J］.Cell Tissue Res，2016，366（2）：341-352.

［13］BELL D S.Changes seen in gut bacteria content and distribution with obesity：causation orassociation［J］.Postgrad Med，2015，127（8）：863-868.

［14］KOGA H，TAMIYA Y，MITSUYAMA K，et al.Probiotics promote rapid-turnover protein production by restoring gut flora inpatients with alcoholic liver cirrhosis［J］.Hepatol Int，2013，7（2）：767-774.

［15］BAJAJ J S，HEUMAN D M，HYLEMON P B，et al.Randomised clinical trial：Lactobacillus GG modulates gut microbiome，metabolome and endotoxemia in patients with cirrhosis［J］.Aliment Pharmacol Ther，2014，39（10）：1113-1125.