實(shí)時熒光定量PCR快速檢測腦膜炎奈瑟菌的臨床價值

王崇義， 史訓(xùn)忠， 孫正林

（1. 寧海縣第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 寧波 315600；2. 寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 寧波 315020）

流行性腦脊髓膜炎（簡稱流腦）是由腦膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis，Nm）引起的急性呼吸道傳染病，是危害人類呼吸道的傳染病之一。流腦的主要傳染源是帶菌者[1]。Nm的攜帶率與流腦的流行有重要的關(guān)系，帶菌率調(diào)查主要采用細(xì)菌培養(yǎng)法檢測[2]。增強(qiáng)對流腦病原菌的監(jiān)測，建立高效的Nm檢測方法對流腦的臨床診斷有重要的意義[3]。流腦的常規(guī)診斷方法是從腦脊液和血液中分離出病原菌，但患者使用抗菌藥物治療后，病原菌的陽性率會顯著下降，因此亟需一個敏感、高效的方法來解決傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法的缺陷[4]。為此，本研究探討了實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測Nm的臨床價值。

1 材料和方法

1.1 一般資料

收集2010年1月—2016年12月寧海縣第一醫(yī)院70例疑似流腦病例的雙份腦脊液標(biāo)本，1份采用細(xì)菌培養(yǎng)法進(jìn)行檢測，將標(biāo)本置于消毒試管內(nèi)，接種于巧克力平板上；另1份采用實(shí)時熒光定量PCR進(jìn)行檢測，需將標(biāo)本保存在生理鹽水中，置-20 ℃環(huán)境中。細(xì)菌培養(yǎng)法所用的儀器與試劑均購自法國生物梅里埃公司，lightcycler 480熒光定量PCR儀（瑞士羅士公司）；K30破裂儀（寧波立誠公司），3111型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），Nm熒光定量PCR檢測試劑盒（上海之江生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)法 將腦脊液標(biāo)本接種于巧克力平板上，于5%～10%CO2環(huán)境中37 ℃培養(yǎng)24～72 h，選取Nm可疑菌落進(jìn)行鑒定、分型和藥物敏感性試驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)時熒光定量PCR 對腦脊液標(biāo)本提取DNA，同時吸取180 μL標(biāo)本，置于1.5 mL離心管中，震蕩混勻，11 544×g離心2 min，去除上清。將100 μL DNA加入沉淀液中，充分混勻，再置沸水浴10 min。最后再對其11 544×g離心5 min，取上清4 μL進(jìn)行檢測。根據(jù)引物進(jìn)行反應(yīng)混合液的配制以及循環(huán)參數(shù)的設(shè)置，同時設(shè)置陽性和陰性對照。結(jié)果根據(jù)lightcycler 480熒光定量PCR儀和試劑盒說明書進(jìn)行評價。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時熒光定量PCR與細(xì)菌培養(yǎng)法檢測Nm結(jié)果的比較

采用細(xì)菌培養(yǎng)法檢出Nm陽性49例，陽性率為70.00%；實(shí)時熒光定量PCR檢出Nm陽性67例，陽性率為95.71%，其中有49例細(xì)菌培養(yǎng)法與實(shí)時熒光定量PCR均為陽性，有18例細(xì)菌培養(yǎng)法為陰性而實(shí)時熒光定量PCR為陽性。實(shí)時熒光定量PCR檢測Nm的陽性率明顯高于細(xì)菌培養(yǎng)法（χ2=16.293 1，P=0.000 1）。見表1。

表1 實(shí)時熒光定量PCR與傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法檢測Nm的結(jié)果

2.2 實(shí)時熒光定量PCR檢測Nm的特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值

實(shí)時熒光定量PCR檢測Nm的特異性為100%，無假陰性結(jié)果，陽性預(yù)測值為73.13%，陰性預(yù)測值為0.00%。見表2。

表2 實(shí)時熒光定量PCR和細(xì)菌培養(yǎng)法的檢測結(jié)果[例（%）]

2.3 實(shí)時熒光定量PCR的敏感性及線性范圍

采用實(shí)時熒光定量PCR檢測10倍系列梯度稀釋的標(biāo)本，分析其敏感性。結(jié)果表明實(shí)時熒光定量PCR最低可以檢測到的Nm DNA濃度為103拷貝/mL。見圖1。

按照實(shí)驗(yàn)要求對選取的模板進(jìn)行10倍系列有效稀釋，并選取7個濃度（2×107～2×103拷貝/mL），同時采用實(shí)時熒光定量PCR檢測。結(jié)果表明在2×103～2×107拷貝/mL范圍內(nèi)，與相應(yīng)的Ct值有較好的相關(guān)性（r值分別為0.999 9、0.999 6、0.999 5、0.999 7）。因此，實(shí)時熒光定量PCR檢測Nm DNA的線性范圍為2×103～2×107拷貝/mL。

圖1 Nm實(shí)時熒光定量PCR曲線

3 討論

流腦是一種嚴(yán)重影響患者健康的冬、春季急性傳染病，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、嘔吐以及頭痛等臨床癥狀。有研究表明，由Nm引起的腦膜炎時常伴隨著較高的死亡率，因此受到臨床的重點(diǎn)關(guān)注[5]。流腦患者通常伴隨發(fā)熱以及頭痛等臨床癥狀，對患者的確診通常需要從患者的腦脊液和血液中分離出Nm。Nm是引起流腦的病原體，其主要寄居在患者上呼吸道內(nèi)，是一種革蘭陰性雙球菌，對干燥、寒冷以及陽光環(huán)境都十分敏感。相關(guān)研究表明，Nm置于室溫中3 h就會死亡[6]。

傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法檢測時間較長，Nm易在標(biāo)本運(yùn)輸過程中死亡，當(dāng)患者接受抗菌藥物治療以及受其他非特異性因素的影響時，會引起細(xì)菌分離的失敗，降低細(xì)菌培養(yǎng)法的準(zhǔn)確性[7]。有研究表明，細(xì)菌培養(yǎng)法分離鑒定Nm的敏感性不高，因此采用敏感性更高的檢測方法變得十分重要且意義重大[8-9]。近年來，敏感性和特異性較高的實(shí)時熒光定量PCR已被廣泛應(yīng)用臨床檢測。該法的主要特點(diǎn)是：（1）采用了熒光標(biāo)記的特異性探針，增強(qiáng)了PCR擴(kuò)增的特異性[10]；（2）采用Ct值定量結(jié)果，能夠有效地定量PCR擴(kuò)增指數(shù)增長期起始的拷貝數(shù)，避免平臺效應(yīng)對結(jié)果的影響，增強(qiáng)方法的敏感性[11]；（3）使用全封閉反應(yīng)，不需要電泳等PCR后期處理，能有效避免PCR產(chǎn)物造成的假陽性污染；（4）檢測過程中進(jìn)行在線式實(shí)時監(jiān)測，測量結(jié)果直觀有效，自動化程度較高[12]。實(shí)時熒光定量PCR檢測Nm的敏感性和特異性高，經(jīng)濟(jì)成本低，為Nm的檢測提供了重要的技術(shù)手段，為正常人群Nm帶菌率的調(diào)查提供了新的方法，也為暴發(fā)流行時快速、低成本的診斷提供了相應(yīng)的技術(shù)支持[13]。PCR技術(shù)能通過對流腦患者的腦脊液或血液標(biāo)本進(jìn)行擴(kuò)增，以擴(kuò)增出特異性DNA片段來診斷Nm感染[14]。實(shí)時熒光定量PCR應(yīng)用了較高的光譜技術(shù)，同時應(yīng)用了高敏感性的儀器檢測熒光，因而熒光定量PCR檢測技術(shù)的敏感性、特異性與細(xì)菌培養(yǎng)法相比都有較大的提升[15]。由此可見，熒光定量PCR檢測技術(shù)的自動化程度及準(zhǔn)確度均較高，還能有效地解決污染問題，檢測時間短，在檢測某些臨床已使用抗菌藥物或保存不當(dāng)?shù)臉?biāo)本、監(jiān)控流腦的早期情況及疾病流行的實(shí)驗(yàn)室快速診斷方面均有十分廣闊的應(yīng)用前景[7]。

本研究結(jié)果顯示，實(shí)時熒光定量PCR檢測Nm的陽性率（95.71%）顯著高于細(xì)菌培養(yǎng)法（70.00%），二者的陽性符合率為70.00%，2種方法完全符合49例，另有18例細(xì)菌培養(yǎng)法為陰性而實(shí)時熒光定量PCR為陽性。這一現(xiàn)象說明實(shí)時熒光定量PCR的敏感性比傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法更高。同時，本研究結(jié)果還表明，實(shí)時熒光定量PCR的特異性達(dá)100%，無假陰性結(jié)果。

綜上所述，實(shí)時熒光定量PCR檢測Nm的敏感性高、特異性強(qiáng)，且快速、簡便，為流腦流行病學(xué)調(diào)查提供了一種快速、簡便的病原學(xué)診斷手段。

[1] 張力文，王宗潤，吳秀麗，等. 實(shí)時熒光定量PCR法檢測人糞便中雙歧桿菌方法的建立及評價[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2014，56（3）：686-691.

[2]PEDERSEN K S，OKHOLM E，JOHANSEN M，et al. Clinical utility and performance of sock sampling in weaner pig diarrhoea[J]. Prev Vet Med，2015，120（3-4）：313-320.

[3]熊長輝，楊夢，劉曉青，等. 腦膜炎奈瑟菌檢測及基因分群[J]. 中國公共衛(wèi)生，2015，31（5）：578-580.

[4]TOCQUEVILLE V，F(xiàn)ERRé S，NGUYEN N H，et al. Multilocus sequence typing ofMycoplasma hyorhinisstrains identified by a real-time TaqMan PCR assay[J]. J Clin Microbiol，2014，52（5）：1664-1671.

[5] 方莉，龍思琪，許媛，等. 實(shí)時熒光PCR法檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的研究[J]. 重慶醫(yī)學(xué)，2013，42（32）：3950-3951.

[6]NYMOEN D A，HETLAND FALKENTHAL T E，HOLTH A，et al. Expression and clinical role of chemoresponse-associated genes in ovarian serous carcinoma[J]. Gynecol Oncol，2015，139（1）：30-39.

[7]KITAJIMA M，HATA A，YAMASHITA T，et al.Development of a reverse transcription-quantitative PCR system for detection and genotyping of aichi viruses in clinical and environmental samples[J]. Appl Environ Microbiol，2013，79（13）：3952-3958.

[8] 牟成惠，宋妙芳，鐘逸雯，等. 實(shí)時熒光雙重PCR檢測610份珠江水霍亂弧菌結(jié)果分析[J]. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2012，28（15）：2598-2600.

[9]TAKEDA M，F(xiàn)UNATO T，IKEMOTO M，et al.Clinical usefulness of the PAXgeneTMbone marrow RNA system for stabilizing total RNA[J]. J Clin Lab Anal，2015，29（1）：61-67.

[10]張?jiān)娒桑∶瑒⒎牵? 基于gyrB序列Taqman實(shí)時熒光PCR檢測在MTC鑒定中的應(yīng)用[J]. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2014，30（3）：472-474.

[11]MARQUART L，BAKER M，O'ROURKE P，et al. Evaluating the pharmacodynamic effect of antimalarial drugs in clinical trials by quantitative PCR[J]. Antimicrob Agents Chemother，2015，59（7）：4249-4259.

[12]程凱，余波，王建東，等. qRT-PCR檢測石蠟包埋組織microRNA的研究進(jìn)展[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2014，30（11）：1273-1275.

[13]PEDERSEN K S，OKHOLM E，JOHANSEN M，et al. Clinical utility and performance of sock sampling in weaner pig diarrhoea[J]. Prev Vet Med，2015，120（3-4）：313-320.

[14]YOU Y，YAO H，YOU B，et al. Clinical significance of HAX-1 expression in laryngeal carcinoma[J]. Auris Nasus Larynx，2015，42（4）：299-304.

[15]M A S T O R A K I S，C H I M O N I D O U M，DIMITRAKOPOULOS L，et al. A rapid and accurate closed-tube methylation-sensitive high resolution melting analysis assay for the semi-quantitative determination of SOX17 promoter methylation in clinical samples[J]. Clin Chim Acta，2015，444：303-309.