植物血凝素刺激外周血單個核細胞Th1/Th2細胞因子分泌對阿爾茨海默病的診斷價值

丁冰玉， 林 萍， 李擎天

（1.上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院檢驗系，上海 200025；2.上海交通大學醫學院附屬精神衛生中心，上海 200030）

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是中樞神經系統的退行性疾病，通常表現為記憶功能和認知功能的進行性喪失，伴隨著人格和行為的改變。其特征性病理改變為淀粉樣β蛋白（amyloid-beta protein，Aβ）沉積形成的細胞外老年斑（senile plaque，SP）和tau蛋白過度磷酸化形成的神經原纖維纏結[1]。目前，AD尚無明確的診斷試驗，只能在患者死亡后通過顯微鏡觀察SP和神經原纖維纏結的存在來準確診斷。

大量研究證據支持，伴隨著神經退行性變化，機體產生的免疫應答對AD發生、發展有重要作用[2]。MüLLER等[3]推測Th1和Th2激活的不平衡可產生N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體激動劑——喹啉酸，其對神經細胞有毒性作用。在此背景下，研究免疫細胞Th1/Th2分泌的細胞因子對AD的診斷意義具有可行性。此外，膽固醇代謝在AD的病理生理中也起到了一定的作用。有研究表明，膽固醇高的受試者對AD的易感性增加，降脂藥物對AD的治療可能有一定的作用[4-7]。

本研究收集AD患者和健康對照者的血液樣本，抽提外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），在植物血凝素（phytohaemagglutinin，PHA）刺激下培養，檢測培養基上清液中的細胞因子水平，同時檢測血清細胞因子及血脂水平，分析各指標對AD的診斷價值，并在6周后重復采樣，以探究指標是否具有穩定性。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2015年9月—2016年10月上海交通大學醫學院附屬精神衛生中心的AD患者樣本100例。AD患者簡易精神狀態檢查（Mini-Mental State Examination，MMSE）評分≤24，入組的患者需排除以下情況：有并發感染史；伴隨或過去有炎癥和/或自身免疫性疾病史；之前發生過短暫性大腦缺血性發作、腦卒中和/或其他腦血管病；存在嚴重頑固性心力衰竭、嚴重腎臟疾病或晚期慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）；有癌癥或血液腫瘤史；伴隨的已知影響認知的醫學、神經或精神疾病；有重大頭部創傷史；近期做過重大手術；在過去24 h內攝入過抗菌藥物；在過去2個月內攝入過降脂藥物；有酗酒和/或濫用藥物史；意識水平受到干擾[8]。AD患者男42例、女58例，年齡（72±11）歲。對照組100例樣本來自上海市閔行區中心醫院的健康體檢者，其中男49名、女51名，年齡（70±9）歲。對照組MMSE評分為30分，排除標準同AD組。

1.2 方法

清晨空腹抽取抗凝全血4 mL，AD組于6周后同一時間點再次抽取血樣。AD組根據不同采樣時間，按先后順序分別記為AD1、AD2。采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離PBMC，利用臺盼藍試驗確定活細胞的數量。PBMC以106/mL濃度重懸于RPMI-1640培養基中，在PHA（10 μg/mL）刺激下，37 ℃、5% CO2培養48 h。48 h后收集培養上清液，-80 ℃凍存。采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）（試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司）對PBMC在PHA刺激下分泌的白細胞介素（interleukin，IL）-1α、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、γ干擾素（interferon gamma，IFN-γ）和血清IL-1α（serum IL-1α，sIL-1α）、血清IL-6（serum IL-6，sIL-6）、血清IL-10（serum IL-10，sIL-10）、血清TNF-α（serum TNF-α，sTNF-α）、血清IFN-γ（serum IFN-γ，sIFN-γ）進行測定。血脂[總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）]水平用UNCEL DXC800全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特公司）進行測定。

1.3 統計學方法

采用SPSS 18.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，各指標診斷效能的評估采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AD組和對照組PBMC在PHA刺激下分泌的細胞因子水平的比較

AD組PHA刺激下的IL-1α、IFN-γ水平明顯高于對照組（P＜0.05），而IL-10水平明顯低于對照組（P＜0.05）；IL-6、TNF-α與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；6周后重新采樣檢測，結果與第1次一致。見圖1。

2.2 AD組和對照組血清細胞因子水平的比較

AD組sIL-6、sTNF-α水平明顯高于對照組（P＜0.05），sIL-1α、sIL-10及sIFN-γ與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。6周后重新采樣檢測，結果與第1次一致。見圖2。

圖1 AD組和對照組PBMC在PHA刺激下分泌的細胞因子水平的比較

2.3 AD組和對照組血脂水平的比較

AD組血清TC、TG及LDL-C明顯高于對照組（P＜0.05），而HDL-C在2個組間差異無統計學意義（P＞0.05）。6周后重新采樣檢測，結果與第1次一致。見表1。

圖2 AD組和對照組血清細胞因子水平的比較

表1 AD組和對照組血脂水平的比較 （mmol/L，±s）

表1 AD組和對照組血脂水平的比較 （mmol/L，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05

組別 例數 TC TG LDL-C HDL-C AD組AD1 100 6.25±0.77* 2.20±0.63* 4.18±0.78* 1.42±0.41 AD2 100 6.33±1.03* 2.27±0.41* 4.32±0.94* 1.42±0.57對照組 100 5.27±0.63 1.46±0.69 3.36±0.62 1.47±0.79

2.4 ROC曲線分析

分析IFN-γ、IL-1α、sIL-6、sTNF-α、TC、TG、LDL-C對AD的診斷價值，同時以IFN-γ代表Th1介導的免疫應答，IL-6和IL-10代表Th2介導的免疫應答，利用細胞因子的比值分析Th1/Th2改變在AD診斷中的敏感性和特異性，評價這種改變作為生物標志物指導AD診斷的意義，結果見圖3，其分析結果及特征性參數見表2。

圖3 評價Th1/Th2、IFN-γ、IL-1α、sIL-6、sTNF-α及血清TC、TG、LDL-C對AD診斷價值的ROC曲線

表2 ROC曲線評價Th1/Th2、IFN-γ、IL-1α、sIL-6、sTNF-α及血清TC、TG、LDL-C對AD診斷價值的特征性參數

3 討論

AD是最常見的神經退行性癡呆，其發生、發展涉及遺傳、環境和生理因素[9]。隨著年齡的增長，老年人體內的血流量及灌注減少，導致活性氧產生和氧化應激失衡，炎癥細胞因子生成增加。細胞因子可影響淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）的表達和促淀粉樣變性過程和/或β-淀粉樣蛋白聚集[10]，導致AD患者大腦的認知區域Aβ異常聚集、增加，刺激免疫系統，誘發炎癥反應的正反饋過程，造成細胞的不可逆損傷[11]。細胞因子還可影響激酶活性，進而導致tau蛋白磷酸化異常[10]。有學者提出，AD患者出現的認知障礙可能是由細胞因子介導的神經元與膠質細胞之間的相互作用造成的[12]。

本研究關注AD患者PBMC在PHA刺激下的Th1/Th2細胞因子水平，PBMC可通過血腦屏障到達中樞神經系統，發揮免疫功能[13]。本研究結果也顯示AD組PHA刺激下的IFN-γ水平明顯高于對照組（P＜0.05）。有研究表明，在促炎性細胞因子IFN-γ的刺激下，被淀粉樣斑塊包繞的小膠質細胞吲哚胺-2，3-二氧化酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）過表達[14]。IDO是犬尿氨酸途徑（kynurenine pathway，KP）的限速酶，影響著色氨酸（tryptophan，TRP）的代謝。IDO的過度表達可引起KP調節異常，TRP向犬尿素（kynurenine，KYN）合成增加，TRP及其代謝產物具有神經毒性，與神經退行性疾病的發病機制有關[4，14]。本研究結果顯示AD患者PBMC分泌的IFN-γ增加，推測其增加引起了IDO過表達，神經毒性喹啉酸產生增加，引起神經元變性，造成了疾病的發生、發展。

本研究結果還顯示IL-6和IL-10趨向下降，而IFN-γ趨向上升，由此推測PHA刺激下細胞因子的產生模式更傾向于Th1介導的免疫應答。6周后重復收集樣本檢測，結果顯示2個時間點PHA刺激的PBMC細胞因子分泌情況一致，提示這種Th1/Th2改變在AD患者中處于穩定狀態，表明可以將這種改變作為AD的生物標志物。PHA刺激下PBMC分泌的IFN-γ、IL-1α水平診斷AD的AUC為0.911、0.644，說明IFN-γ水平對AD有一定的診斷價值；Th1/Th2（IFN-γ/IL-6比值、IFN-γ/IL-10比值）診斷AD的AUC分別為0.951、0.912，說明Th1/Th2改變對AD有診斷價值，IFN-γ/IL-6比值對AD的診斷價值比IFN-γ/IL-10比值更高，且Th1/Th2改變的診斷價值比單個細胞因子水平的診斷價值更高。

本研究還對AD患者血清細胞因子進行了測定，發現sIL-6、sTNF-α水平明顯高于對照組（P＜0.05），這與文獻報道[15-18]一致，且sIL-6、sTNF-α診斷AD的AUC為0.894、0.888。由此可見，sIL-6、sTNF-α水平均對AD有一定的診斷價值，但診斷價值低于PHA刺激下PBMC分泌的IFN-γ水平。

正常機體內的APP由α-內分泌酶催化裂解生成可溶性蛋白片段，而由β-內分泌酶催化生成Aβ。在高膽固醇水平下，α-內分泌酶活性受到一定抑制，APP經由β-內分泌酶催化增多，Aβ生成增加[6]。有研究表明，血脂代謝異常還顯著影響tau蛋白過度磷酸化，從而導致AD的發生[5]。本研究中AD患者TC、TG以及LDL-C水平明顯高于對照組，且指標的升高在6周后仍能被檢測到。TC、TG、LDL-C診斷AD的AUC分別為0.912、0.911、0.897，結合老年人因代謝水平降低引起的血脂生理性升高，提示這3項指標可作為AD的風險評估指標。

綜上所述，PHA刺激下PBMC的IFN-γ等細胞因子分泌水平、血清細胞因子水平及血脂水平異常可能與AD發病相關，其中PHA刺激的IFN-γ及sIL-6、sTNF-α、TC、TG、LDL-C水平對AD有一定的診斷價值。

[1]NORDBERG A. Dementia in 2014. Towards early diagnosis in Alzheimer disease[J]. Nat Rev Neurol，2015，11（2）： 69-70.

[2]RICHARTZ E，STRANSKY E，BATRA A，et al.Decline of immune responsiveness：a pathogenetic factor in Alzheimer's disease?[J]. J Psychiatr Res，2005，39（5）：535-543.

[3]MüLLER N，SCHWARZ M J. Neuroimmuneendocrine crosstalk in schizophrenia and mood disorders[J]. Expert Rev Neurother，2006，6（7）： 1017-1038.

[4]SHAHBAZI S，KAUR J，KUANAR A，et al.Risk of late-onset Alzheimer's disease by plasma cholesterol：rational in silico drug investigation of pyrrole-based HMG-CoA reductase inhibitors[J].Assay Drug Dev Technol，2017，15（7）：342-351.

[5]BORRONI B，COLCIAGHI F，LENZI G L，et al. High cholesterol affects platelet APP processing in controls and in AD patients[J]. Neurobiol Aging，2003，24（5）：631-636.

[6]SOLOMON A，KIVIPELTO M，WOLOZIN B，et al. Midlife serum cholesterol and increased risk of Alzheimer's and vascular dementia three decades later[J]. Dement Geriatr Cogn Disord，2009，28（1）：75-80.

[7]PAPPOLLA M A，BRYANT-THOMAS T K，HERBERT D，et al. Mild hypercholesterolemia is an early risk factor for the development of Alzheimer amyloid pathology[J]. Nueurology，2003，61（2）：199-205.

[8]D'ANNA L，ABU-RUMEILEH S，FABRIS M，et al. Serum interleukin-10 levels correlate with cerebrospinal fluid amyloid beta deposition in Alzheimer disease patients[J]. Neurodegener Dis，2017，17（4-5）：227-234.

[9]BAGYINSZKY E，GIAU V V，SHIM K，et al.Role of inflammatory molecules in the Alzheimer's disease progression and diagnosis[J]. J Neurol Sci，2017，376：242-254.

[10]DOMINGUES C，DA CRUZ E SILVA OAB，HENRIQUES A G. Impact of cytokines and chemokines on Alzheimer's disease neuropathological hallmarks[J]. Curr Alzheimer Res，2017，14（8）：870-882.

[11]MCNAULL B B，TODD S，MCGUINNESS B，et al. Inflammation and anti-inflammatory strategies for Alzheimer's disease-a mini-review[J].Gerontology，2010，56（1）：3-14.

[12]JULIAN A，DUGAST E，RAGOT S，et al. There is no correlation between peripheral inf l ammation and cognitive status at diagnosis in Alzheimer's disease[J].Aging Clin Exp Res，2015，27（5）：589-594.

[13]S A R E S E L L A M，M A RV E N TA N O I，CALABRESE E，et al. A complex proinf l ammatory role for peripheral monocytes in Alzheimer's disease[J]. J Alzheimers Dis，2014，38（2）：403-413.

[14]YAMADA A，AKIMOTO H，KAGAWA S，et al. Proinflammatory cytokine interferon-gamma increases induction of indoleamine 2，3-dioxygenase in monocytic cells primed with amyloid beta peptide 1-42：implications for the pathogenesis of Alzheimer's disease[J]. J Neurochem，2009，110（3）：791-800.

[15]DURSUN E，GEZEN-AK D，HANAGˇASI H，et al. The interleukin 1 alpha，interleukin 1 beta，interleukin 6 and alpha-2-macroglobulin serum levels in patients with early or late onset Alzheimer's disease，mild cognitive impairment or Parkinson's disease[J]. J Neuroimmunol，2015，283：50-57.

[16]HELMY A A，NASEER M M，SHAFIE S E，et al. Role of interleukin 6 and alpha-globulins in differentiating Alzheimer and vascular dementias[J].Neurodegener Dis，2012，9（2）：81-86.

[17]COJOCARU I M，COJOCARU M，MIU G，et al.Study of interleukin-6 production in Alzheimer's disease[J]. Rom J Intern Med，2011，49（1）：55-58.

[18]GEZEN-AK D，DURSUN E，HANAGˇASI H，et al. BDNF，TNFα，HSP90，CFH，and IL-10 serum levels in patients with early or late onset Alzheimer's disease or mild cognitive impairment[J]. J Alzheimers Dis，2013，37（1）：185-195.