EB病毒感染患兒淋巴細(xì)胞亞群特征和EBV DNA載量分析

榮婷婷， 王維維， 王娟娟， 章黎華， 沈立松

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200092）

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）屬皰疹病毒科γ皰疹病毒亞科，為雙鏈DNA病毒。有文獻(xiàn)報(bào)道，全世界約有90%的人曾感染過(guò)EBV[1]。EBV感染在兒科臨床很常見(jiàn)，學(xué)齡前期及學(xué)齡期兒童多以傳染性單核細(xì)胞增多癥（infectious mononucleosis，IM）為表現(xiàn)。IM的特征是患者有大量的單個(gè)核細(xì)胞增生，其中主要是EBV特異性CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的增殖、活化[2]。而兒童慢性活動(dòng)性EB病毒（chronic active Epstein-Barr virus，CAEBV）感染的病情與IM比較，更嚴(yán)重且容易反復(fù)，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)多器官衰竭而導(dǎo)致死亡[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞等在不同疾病轉(zhuǎn)歸的EBV感染患兒中的變化特點(diǎn)不同[4-5]。另?yè)?jù)報(bào)道，IM患兒血清EBV DNA載量與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)[6]，DNA的血清載量分析對(duì)于診斷CAEBV感染也非常有意義[7]。

本研究旨在采用流式細(xì)胞術(shù)分析IM和CAEBV感染患兒的淋巴細(xì)胞表型，并對(duì)免疫細(xì)胞亞群進(jìn)行定量檢測(cè)，分析IM和CAEBV感染患兒免疫狀態(tài)的特點(diǎn)，又通過(guò)檢測(cè)血清EBV DNA載量了解不同疾病狀態(tài)下病毒的活動(dòng)情況，從而為IM與CAEBV感染2種疾病的鑒別診斷提供幫助。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016年1—12月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院診治且進(jìn)行過(guò)淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)的EBV感染患兒35例，其中IM患兒（IM組）17例（男10例，女7例，年齡1～4歲）、CAEBV患兒（CAEBV組）18例（男15例，女3例，年齡3～14歲）。以同期上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院體檢健康兒童15名（男10例，女5例，年齡5～14歲）作為健康對(duì)照組。

IM診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）以急性發(fā)熱、咽峽炎、淋巴結(jié)腫大、肝脾大等為主要臨床表現(xiàn)；（2）淋巴細(xì)胞比例增加（＞50%），異形淋巴細(xì)胞比例增加（＞10%）；（3）EBV衣殼抗原（viral-capsid antigen，VCA）免疫球蛋白M（immunoglobulin，IgM）陽(yáng)性和／或外周血EBV DNA陽(yáng)性；（4）除外巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）、人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）等感染。CAEBV感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照OKANO等[8]建議的標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床表現(xiàn)為持續(xù)或復(fù)發(fā)性IM樣癥狀；（2）異常的EBV VCA抗體和早期抗原（early antigen，EA）抗體滴度升高和/或受累組織及外周血EBV DNA增加；（3）慢性病程無(wú)法用其他已知疾病解釋。

1.2 方法

1.2.1 各淋巴細(xì)胞及其亞群比例的檢測(cè) 采用FACSC anto型流式細(xì)胞分析儀及配套試劑（美國(guó)BD公司）測(cè)定T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+以及CD19+淋巴細(xì)胞和CD56+CD16+NK細(xì)胞的比例和計(jì)數(shù)。

1.2.2 EBV DNA的定量檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)EBV DNA載量，試劑由湖南圣湘基因股份有限公司生產(chǎn)，MX3000實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自上海吉泰生物科技有限公司。嚴(yán)格按儀器和試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)用中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，非正態(tài)分布資料或等級(jí)資料多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IM組與CAEBV組血清EBV抗體與EBV DNA載量比較

IM組EBV VCA IgM陽(yáng)性15例，陰性2例；EBV VCA IgG陽(yáng)性16例，陰性1例；EBV DNA均為陽(yáng)性，載量為3.60（1.50，7.15）×103拷貝/mL。CAEBV組EBV VCA IgM抗體、EBV VCA IgG抗體均陽(yáng)性14例，EBV VCA IgM抗體陰性而EBV VCA IgG抗體陽(yáng)性4例；EBV DNA均為陽(yáng)性，載量為1.25（0.19，2.95）×104拷貝/mL。IM組EBV DNA載量明顯低于CAEBV組（P=0.027）。

2.2 IM組、CAEBV組和健康對(duì)照組淋巴細(xì)胞比例和計(jì)數(shù)的比較

IM組淋巴細(xì)胞比例和計(jì)數(shù)最高，中位數(shù)分別為65.90%和7 610個(gè)/μL，CAEBV組淋巴細(xì)胞比例的中位數(shù)為48.40%，也高于健康對(duì)照組（29.71%），而CAEBV組的淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)較健康對(duì)照組升高不明顯。見(jiàn)表1。

2.3 IM組、CAEBV組和健康對(duì)照組B、NK、CD4+T和CD8+T細(xì)胞比例和計(jì)數(shù)的比較

IM組B、NK、CD4+T、CD8+T 4種淋巴細(xì)胞亞群呈現(xiàn)不同的變化，CD8+T細(xì)胞明顯增加，比例和計(jì)數(shù)的中位數(shù)分別為61.50%和517 個(gè)/μL，均顯著高于健康對(duì)照組和CAEBV組（P＜0.05）；B、NK、CD4+T 3種細(xì)胞的比例與健康對(duì)照組比較均顯著降低（P＜0.05），但3種細(xì)胞的計(jì)數(shù)均增加（P＜0.05）。CAEBV組僅NK細(xì)胞比例較健康對(duì)照組出現(xiàn)明顯下降（P＜0.05），其余差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。值得注意的是，CAEBV組與IM組比較，CD4+T細(xì)胞的比例升高而計(jì)數(shù)下降，而CD8+T細(xì)胞的比例和計(jì)數(shù)明顯降低，2個(gè)組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.4 EBV DNA載量與淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性

IM組和CAEBV組EBV DNA載量與淋巴細(xì)胞亞群無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表1 健康對(duì)照組、IM組和CAEBV組外周血淋巴細(xì)胞比例及計(jì)數(shù) [M（P25，P75）]

表2 健康對(duì)照組、IM組和CAEBV組外周血B、NK細(xì)胞比例及計(jì)數(shù) [M（P25，P75）]

表3 EBV DNA載量與淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性

3 討論

EBV被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)歸為I類致癌物質(zhì)，是一種嗜淋巴細(xì)胞的DNA病毒，屬皰疹病毒屬，具有潛伏和轉(zhuǎn)化的特性[9]。有研究結(jié)果顯示，EBV感染可導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞免疫功能的不足和缺乏，可直接引起IM，同時(shí)可使T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞具備無(wú)限增殖和轉(zhuǎn)化為惡性疾病的能力，并與若干惡性腫瘤的發(fā)生有相關(guān)性[10-12]。機(jī)體感染EBV后，細(xì)胞免疫功能可發(fā)生紊亂，有研究報(bào)道證實(shí)，原發(fā)性EBV感染的最初靶細(xì)胞為B細(xì)胞，同時(shí)B細(xì)胞也成為病毒終生潛伏的場(chǎng)所[13]。B細(xì)胞介導(dǎo)了原發(fā)性、持續(xù)性的EBV感染，感染EBV后能無(wú)限增殖。在機(jī)體免疫狀態(tài)正常的情況下，這種增殖的B細(xì)胞會(huì)刺激T細(xì)胞的免疫反應(yīng)，將感染EBV的B細(xì)胞殺滅，從而起到清除病毒的作用。而IM患兒的外周血出現(xiàn)的異形淋巴細(xì)胞并不是由病毒復(fù)制直接引起的，而是T細(xì)胞免疫反應(yīng)的結(jié)果[14]。HOSHINO等[15]曾對(duì)急性EBV感染的患兒進(jìn)行連續(xù)抽血檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EBV的量與特異性的CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的量密切相關(guān)。CD4+/CD8+比值是重要的反映免疫狀態(tài)的檢測(cè)指標(biāo)，其比例的降低與免疫系統(tǒng)損傷的程度相關(guān)。IM和CAEBV感染同為EBV感染，但CAEBV感染病情較重且容易反復(fù)，預(yù)后不良，嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致死亡，且一些CAEBV感染患者有過(guò)IM或類似IM癥狀。因此，臨床上早期鑒別診斷IM與CAEBV感染很重要，可提早進(jìn)行恰當(dāng)?shù)母深A(yù)和治療，防止病情惡化。

EBV抗體測(cè)定是診斷IM與CAEBV感染的重要手段。本研究結(jié)果顯示，大部分EBV感染患兒均出現(xiàn)了EBV抗體的升高，但也有個(gè)別病例并未發(fā)現(xiàn)抗體水平升高，并且IM患兒和CAEBV感染患兒在抗體表達(dá)上難以發(fā)現(xiàn)明顯差異，抗體滴度的變化僅能作為EBV感染的輔助診斷。本研究結(jié)果顯示，IM淋巴細(xì)胞比例和計(jì)數(shù)均明顯升高，最主要原因是CD8+T細(xì)胞的比例和計(jì)數(shù)大幅上升，而CAEBV組淋巴細(xì)胞比例有升高，但CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞與健康對(duì)照組相比變化不顯著，B細(xì)胞和NK細(xì)胞比例和計(jì)數(shù)也未出現(xiàn)明顯降低，這與以往關(guān)于成人的文獻(xiàn)報(bào)道[16]有所不同，原因可能是本研究較早期地對(duì)CAEBV感染患兒的淋巴細(xì)胞亞群特征進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，患兒的免疫細(xì)胞功能還未出現(xiàn)明顯下調(diào)，另外兒童與成人對(duì)于EBV感染的免疫應(yīng)答可能存在不同之處，尚需進(jìn)一步研究。本研究中CAEBV組與IM組比較，B細(xì)胞計(jì)數(shù)變化無(wú)明顯差異，NK細(xì)胞降低，與以往文獻(xiàn)報(bào)道[17]也有所不同，但CD8+T細(xì)胞的變化與文獻(xiàn)報(bào)道[17]一致，進(jìn)一步證明了IM患者CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的大量增殖導(dǎo)致了病毒的清除，而CAEBV感染患者存在這種免疫反應(yīng)的缺陷，使病毒無(wú)法得到有效清除，臨床上表現(xiàn)為病情重且遷延不愈，甚至進(jìn)一步發(fā)展為淋巴瘤或白血病，預(yù)后差的結(jié)論。本研究同時(shí)還分析了2種EBV感染疾病患兒的EBV DNA載量差異，結(jié)果顯示IM組EBV DNA載量明顯低于CAEBV組（P=0.027）。依據(jù)本研究的結(jié)果，對(duì)于臨床上早期初診EBV感染的患兒，如果CD8+T細(xì)胞的比例和計(jì)數(shù)沒(méi)有大幅上升并且EBV DNA載量又比較高，應(yīng)警惕其為CAEBV感染患兒，臨床上應(yīng)引起足夠重視。由于本研究選擇樣本為小樣本，研究結(jié)果還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。尤其對(duì)于EBV DNA載量與患兒淋巴細(xì)胞亞群特征的相關(guān)性還需要大樣本數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析。

綜上所述，臨床上對(duì)于確診為EBV感染的患兒可以根據(jù)淋巴細(xì)胞亞群分析和EBV DNA載量測(cè)定輔助鑒別診斷IM和CAEBV感染，以便及時(shí)調(diào)整治療方案，避免患兒病情加重。

[1]MACARTHUR G J，WILSON A D，BIRCHALL M A，et al. Primary CD4+ T-cell responses provide both helper and cytotoxic functions during Epstein-Barr virus infection and transformation of fetal cord blood B cells [J]. J Virol，2007，81（9）：4766-4775.

[2]SCHERRENBURG J，PIRIOU E R，NANLOHY N M，et a1. Detailed analysis of Epstein-Barr virusspecific CD4+ and CD8+ T cell responses during infectious mononucleosis [J]. Clin Exp Immunol，2008，153（2）：231-239.

[3]FUJIWARA S，KIMURA H，IMADOME K，et al.Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan [J]. Pediatr Int，2014，56（2）：159-166.

[4]任淑紅，王強(qiáng)，房俊，等. 兒童傳染性單核細(xì)胞增多癥T細(xì)胞亞群及B細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化研究[J]. 中華婦幼臨床醫(yī)學(xué)雜志（電子版），2009，5（5）：466-469.

[5]邢燕，宋紅梅，李太生，等. 慢性活動(dòng)性EB病毒感染外周血淋巴細(xì)胞免疫亞群變化特征的研究[J]. 中華兒科雜志，2009，47（6）：441-445.

[6]BALFOUR H H Jr，HOLMAN C J，HOKANSON K M，et al. A prospective clinical study of Epstein-Barr virus and host interactions during acute infectious mononucleosis [J]. J Infect Dis，2005，192（9）：1505-1512.

[7]ITO Y，SUZUKI M，KAWADA J，et al. Diagnostic values for the viral load in peripheral blood mononuclear cells of patients with chronic active Epstein-Barr virus disease [J]. J Infect Chemother，2016，22（4）：268-271.

[8]OKANO M，KAWA K，KIMURA H，et a1.Proposed guidelines for diagnosing chronic active Epstein-Barr virus infection[J]. Am J Hematol，2005，80（1）：64-69.

[9]YASUTOMO K. The cellular and molecular mechanism of CD4+/CD8+lineage commitment[J]. J Med Invest，2002，49（1-2）：1-6.

[10]LADELL K，DORNER M，ZAUNER L，et al.Immune activation suppresses initiation of lytic Epstein-Barr virus infection [J]. Cell Microbiol，2007，9（8）：2055-2069.

[11]YAJIMA M，IMADOME K，NAKAGAWA A，et al. A new humanized mouse model of Epstein-Barr virus infection that reproduces persistent infection，lymphoproliferative disorder，and cell-mediated and humoral immune responses [J]. J Infect Dis，2008，198（5）：673-682.

[12]PARK S，KO Y H. Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorders[J]. J Dermatol，2014，41（1）：29-39.

[13]K A R A J A N N I S M A，H U M M E L M，ANAGNOSTOPOULOS I，et a1. Strict lymphotropism of Epstein-Barr virus during acute infectious mononucleosis in nonimmunocompromised individuals[J]. Blood，1997，89（8）：2856-2862.

[14]SILINS S L，SHERRITT M A，SILLERI J M，et a1. Asymptomatic primary Epstein-Barr virus infection occurs in the absence of blood T-cell repertoire perturbations despite high levels of systemic viral load [J]. Blood，2001，98（13）：3739-3744.

[15]HOSHINO Y，NISHIKAWA K，ITO Y，et a1.Kinetics of Epstein-Barr virus load and virus-specif i c CD8+ T cells in acute infectious mononucleosis[J]. J Clin Virol，2010，50（3）：244-246.

[16]謝靜，王煥玲，邱志峰，等. 成人傳染性單核細(xì)胞增多癥和慢性活動(dòng)性EB病毒感染外周血淋巴細(xì)胞亞群分析[J]. 中華內(nèi)科雜志，2016，55（6）：455-459.

[17]茅君卿，楊世隆，宋華，等. 兒童慢性活動(dòng)性EB病毒感染臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查特征 [J]. 中國(guó)當(dāng)代兒科雜志，2014，16（11）：1081-1085.