2型糖尿病患者腸道雙歧桿菌菌群功能狀態與其GLP-1含量變化的關聯性分析

王笑燁，于軼楠，米垚川，辛爽清，梁麗

（中國醫科大學人民醫院，遼寧省人民醫院內分泌二科，遼寧 沈陽 110016）

2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）作為內分泌代謝性疾病，主要與種族、環境、遺傳、生活方式等因素有關，但隨臨床不斷深入研究，發現腸道菌群與T2DM、肥胖等代謝性疾病具有一定相關性，并指出腸道菌群參與能量代謝及BMI控制[1]。亦有學者研究報道，多數T2DM患者存在類桿菌含量降低、腸桿菌科細菌含量增多等腸道菌群失調現象[2]。雙歧桿菌屬專性厭氧菌，可將宿主攝入碳水化合物轉化為脂肪酸，生成酸性腸道環境，競爭性排除其他致病菌，起到保護宿主的作用。GLP-1作為腸促胰島素，不僅可促進胰島素β細胞釋放，且可抑制β細胞凋亡[3]。因此，GLP-1濃度是否正常對T2DM治療效果及預后改善等方面具有積極臨床意義。本研究選取52例T2DM患者，通過設置對照組，分析腸道雙歧桿菌菌群功能狀態與GLP-1含量變化的關聯性，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年3月～2017年3月本院52例T2DM患者作為研究組，男32例，女20例；年齡35～72歲，平均年齡（54.51±10.32）歲；并納入同期51名健康體檢者作為對照組，男31名，女20名；年齡34～73歲，平均年齡（53.87±10.17）歲。兩組在年齡、性別等方面對比具有均衡性，差異無統計學意義，具有可比性。本研究經本院倫理委員會批準通過。

1.2 納入及排除標準 ①納入標準：均符合T2DM相關診斷標準：FBG＞7.0 mmol/L，2 h PG＞11.1 mmol/L；知情本研究，自愿簽署知情同意書。②排除標準：合并肝腎等重要臟器功能障礙者；合并胃腸道疾病者；合并甲狀腺疾病、惡性腫瘤者；以往1個月內使用抗生素及葡萄糖苷酶抑制劑者。

1.3 方法 ①腸道雙歧桿菌菌群檢測方法。取2 g濕重糞便樣品溶于滅菌PBS（20 ml），震蕩搖勻，10 min后，以3 000 r/min速度離心5 min，取上清，上述操作重復3次，以12 000 r/min速度離心10 min，棄上清，取沉淀并使用PBS（20 ml）懸浮，12 000 r/min速度離心5 min，重復3次，將洗滌后菌體用無菌水（2 ml）懸浮混勻，分別裝入2個EP管（規格為1.5 ml），12 000 r/min速度離心5 min，用于DNA提取。以嬰兒雙歧桿菌、雙歧桿菌總菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、長雙歧桿菌的16 SrRNA基因序列為根據，通過引物設計軟件設計對應PCR引物，經BLAST檢索證實引物特異性。以健康體檢者糞便提取細菌基因組DNA為模板，行常規PCR反應，反應體系參數：dNTP Mixture 2 μl，10×PCR Buffer 2 μl，DNA模板3 μl，10 μmol/L 上下游引物各 0.5 μl，ddH2O 11.5 μl，5 U/μl Ex Taq酶0.5 μl；擴增程序參數：95℃預變性1 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，72℃延伸5 min，按照上述方式循環35次。利用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴增產物，相對分子質量標準為DNA marker DL2000。將嬰兒雙歧桿菌、雙歧桿菌總菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、長雙歧桿菌的PCR擴增產物純化回收后作為目的DNA片段，連接pMD18-T載體，重組質粒轉化到大腸桿菌Top10宿主細胞，篩選后得到陽性克隆，制備質粒，經PCR鑒定后作為標準品，做10倍系列稀釋后生成1012～102拷貝/ml，行定時熒光定量PCR反應，反應體系參數：SYBR premix（2×）10 μl，10 μmol/L上下游引物各0.6 μl，ddH2O 6.4 μl，模板2 μl，ROX Reference Dye（50×）0.4 μl；反應條件：95℃變性30 s；95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸34 s，循環40次；融解：95 ℃15 s，60 ℃1 min，95℃15 s；冷卻：60℃15 s。每個樣品每次反應做一復孔，做陰性與陽性對照，根據樣本Ct值與標準線計算5種細菌拷貝數。②GLP-1水平檢測方法。采集4 ml清晨空腹靜脈血，離心取上清液，通過酶聯免疫吸附法檢測兩組GLP-1水平，試劑盒武漢默沙克生物科技有限公司提供，按照試劑盒說明書操作。

1.4 統計學方法 采用統計學軟件SPSS 20.0進行數據分析，計量資料采用“±s”表示，采用t檢驗；采用Spearman進行相關性分析，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組GLP-1水平對比 研究組血清GLP-1水平為（3.11±0.66）mmol/L，對照組為（5.18±0.93）mmol/L。兩組血清GLP-1水平相比，差異有統計學意義（t=13.047，P=0.000），見表1。

表1 兩組GLP-1水平對比（±s，mmol/L）Table 1 Comparison of GLP-1 level in the two groups(±s,mmol/L)

表1 兩組GLP-1水平對比（±s，mmol/L）Table 1 Comparison of GLP-1 level in the two groups(±s,mmol/L)

GLP-1 3.11±0.66 5.18±0.93 13.047 0.000組別研究組對照組t值P值例數52 51

2.2 兩組腸道雙歧桿菌菌群數量對比 研究組青春雙歧桿菌、雙歧桿菌總菌、雙歧桿菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌數量低于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組腸道雙歧桿菌菌群數量對比（±s）Table 2 Comparison of the number of intestinal bifidobacteria in the two groups(±s)

表2 兩組腸道雙歧桿菌菌群數量對比（±s）Table 2 Comparison of the number of intestinal bifidobacteria in the two groups(±s)

P值0.000 0.000 0.000 0.042 0.000項目嬰兒雙歧桿菌雙歧桿菌總菌長雙歧桿菌短雙歧桿菌青春雙歧桿菌研究組（n=52）3.81±0.54 10.95±0.27 3.48±0.21 3.93±0.16 3.43±0.18對照組（n=51）4.18±0.51 11.55±0.25 3.69±0.34 4.01±0.23 4.02±0.27 t值3.573 11.696 3.779 2.052 13.072

2.3 相關性分析 經Spearman相關性分析可知，T2DM患者青春雙歧桿菌、雙歧桿菌總菌數量與GLP-1含量呈正相關（均P＜0.05），長雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、短雙歧桿菌與GLP-1含量無明顯相關性，見表3。

表3 相關性分析Table 3 Correlation analysis

3 討論

T2DM作為臨床多發疾患，占糖尿病患者90%左右[4]。大多數患者以胰島素抵抗為主要特征，但由于其早期無明顯癥狀，僅伴有口渴、輕度乏力等現象，多于明確診斷前并發微血管神經等并發癥，藥物是治療T2DM有效手段，但長期服用降糖藥物具有一定副作用，長期療效欠佳[5]。

雙歧桿菌作為人體腸道重要菌群，多用于預防與治療腸道相關疾病，口服后可促使腸道有益菌生長繁殖，優化腸道環境。研究證實，其數量減少可引起整個腸道微生態失衡、菌群失調，導致多種代謝性疾病出現[6]。加之腸道菌群數量龐大，使用傳統細菌定量法檢查及等待時間較長，且易受培養方法、培養基、外界環境等影響，致使檢出結果存在一定誤差。故本研究采取定時熒光定量PCR方法，不僅可準確、快速定量腸道菌群，且存在污染小、敏感性強、高通量、穩定性好等優勢。GLP-1是一種多肽，參與糖代謝發生與發展，可通過降低β細胞高糖毒性、阻礙β細胞凋亡等方式調節β細胞數目，提高胰島β細胞功能。同時可刺激生長抑素與胰島素釋放，降低高血糖素釋放，減少肝糖原生成。此外，其在T2DM患者體內呈低表達，若及時予以外源性GLP-1，可有效降低血糖水平，增加胰島素釋放，且不會增加低血糖等發生風險[7]。本研究結果顯示，研究組GLP-1水平、腸道雙歧桿菌菌群數量低于對照組（P＜0.05），提示T2DM患者體內GLP-1濃度較低，且腸道雙歧桿菌菌群數量較少。此外，有學者研究指出，青春雙歧桿菌有助于改善2型糖尿病大鼠脂質代謝及腸道菌群失調等現象[8]。本研究結果還顯示，經Spearman相關性分析可知，T2DM患者青春雙歧桿菌、雙歧桿菌總菌數量與GLP-1含量呈正相關（均P＜0.05），提示GLP-1含量與青春雙歧桿菌、雙歧桿菌總菌數量密切相關，可在一定程度上反映機體代謝情況。

綜上，T2DM患者GLP-1含量與青春雙歧桿菌、雙歧桿菌總菌數量呈正相關，可在一定程度上反映機體代謝情況。但本研究僅初步探識GLP-1含量與腸道雙歧桿菌菌群功能狀態關聯性，其具體作用機制有待臨床擴大病例研究證實。

[1] 潘寶龍,巫玲,馬潤玫,等.脂肪因子Omentin-1、Visfatin體外表達與老年2型糖尿病胰島素抵抗的關系[J].中國老年學雜志,2017,37(10):2356-2359.

[2] 江育才.2型糖尿病患者腸道菌群及細胞因子的變化分析[J].中國微生態學雜志,2016,28(4):429-431.

[3] 梁鳳莊.2型糖尿病病人雙歧桿菌菌群紊亂對腸道L細胞分泌胰高血糖素樣多肽的影響[J].護理研究,2016,30(16):2043-2044.

[4] 涂瑞芳,蔣玲慧,張期,等.冠狀動脈CT造影對2型糖尿病患者粥樣硬化斑塊的應用價值[J].當代醫學,2017,23(26):71-73.

[5] 陳彥.依帕司他對早期2型糖尿病腎病的保護作用[J].當代醫學,2017,23(28):73-75.

[6] 許海波.315例老年2型糖尿病患者腸道菌群特征與血糖控制水平分析[J].中國醫師雜志,2017,19(1):130-132.

[7] 劉璠,楊愛格,賈新菊,等.人GLP-1類似物對2型糖尿病輕度認知功能損害患者血清TNF-α、sICAM-1及sVCAM-1的影響[J].現代中西醫結合雜志,2016,25(35):3880-3882.

[8] 宋丹丹,劉煜.腸道菌群變化在2型糖尿病診療中的價值[J].中國實驗診斷學,2017,21(1):184-187.