鎂摻雜納米羥基磷灰石的制備及其在載藥方面的應用

馬曉雨 劉永佳 朱邦尚＊,,2

(1上海交通大學化學與化工學院，上海 200240)

(2上海交通大學分析測試中心，上海 200240)

羥基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2，Hydroxyapatite,HA),與人體內骨組織和牙齒等礦化組織中的無機質在化學成分和結構上相似[1-4]，具有良好的生物活性和生物相容性[5-7]，可作為藥物載體用于藥物的負載和釋放[8-10]，在釋放藥物后可被人體降解吸收或全部隨糞便排出，被認為是具有發展前景的生物活性材料之一。羥基磷灰石可被其他陰陽離子替換，通過摻雜不同的金屬元素(如 Mg2+、Cu2+、Sr2+、Zn2+等)或陰離子(CO32-、F-等)可使羥基磷灰石具有不同的形貌[2,11-12]，進而影響其穩定性、比表面積和對藥物的負載能力等[13-14]。

HA具有很好的生物相容性和生物安全性。同時，它的化學穩定性很好，對許多藥物都不起化學反應，可以作為多種藥物的緩釋載體使用。HA一般為納米實心棒狀結構，不像碳納米管具有空腔結構，載藥量不夠高(低于10%)，因此，人們采用與其它材料復合如殼聚糖或制備成微球結構來解決上述問題[15-16]。但對直接從合成途徑設計對HA納米棒結構進一步改性，實現比表面面積的有效增加目前報道的還較少。鎂(Mg)與鈣(Ca)元素同屬堿土金屬即元素周期表中ⅡA族元素，化學性質非常相近。Mg是人體必須的微量元素之一，對人體起著十分重要的作用，可參與催化人體內200多個酶生物反應過程，并且Mg在維持骨骼細胞結構結合骨骼韌性方面起了重要作用[17-18]。Mg取代羥基磷灰石中Ca的位置后，會使羥基磷灰石的晶體結構發生變化，從而使羥基磷灰石的形貌和理化性質發生改變[19]。近年來，已有文獻報道多種Mg摻雜的羥基磷灰石的合成方法，這些研究表明，Mg的摻雜對于羥基磷灰石的生物活性有明顯的提高。例如，Kalita[20]將氧化鎂和氧化鋅作為摻雜劑加入到羥基磷灰石前驅體粉末中，通過高溫固相合成了Mg/Zn-HA，其力學性能與生物活性均優于單純的HA；Kim[21]利用化學共沉淀法合成了Si/Mg-HA，具有良好的生物活性，可用于骨填充材料。但是由于Mg與Ca的離子半徑與親水性都相似，會引起離子競爭效應，降低產物的結晶度[22-23]。

本文擬利用與鈣元素化學和生物學性能相近的鎂元素摻雜HA,Ca10(PO4)6(OH)2分子結構中Ca部分被Mg取代形成MgxCa10-x(PO4)6(OH)2復合物，能在HA納米棒狀結構上形成缺陷，從而增大HA比表面積和提高生物化學活性，對于載藥能力的有效提高和藥物的緩釋能起重要作用。研究通過逐步化學沉淀反應和Mg2+、Ca2+離子置換反應一鍋法制備了一系列不同含量鎂摻雜的納米羥基磷灰石(Mg-HA)。將以 Mg(NO3)2·6H2O 和(NH4)2HPO4發生反應形成納米羥基磷酸鎂為前驅體，進一步滴加Ca(NO3)2·4H2O和(NH4)2HPO4溶液最終形成Mg-HA。對其納米粉體的理化特性、生物學性能進行表征，選擇化療藥物順鉑 (Cisplatin，cDDP)作為模型藥物，評價新型Mg-HA納米材料載藥特性及其在藥物載體方面的應用前景。

1 實驗部分

1.1 原料與試劑

四水合硝酸鈣(Ca(NO3)2·4H2O，AR)，六水合硝酸鎂(Mg(NO3)2·6H2O，AR)，磷酸氫二銨((NH4)2HPO4，AR)，二甲亞砜(C2H6SO，dimethyl sulfoxide，DMSO)均購于國藥集團化學試劑有限公司；濃氨水(含量(以NH3計)25%～28%，AR)購于上海聯試有限公司；1,1,1-三羥甲基乙烷(1,1,1-tris(hydroxymethyl)ethane，TME，97%)，順鉑(cis-diammineplatinumギ dichloride,cDDP，Pt 65%) 均購于 Alfa Aesar；胎牛血清(FBS)、DMEM干粉培養基 (高糖)、青-鏈霉素、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液、非必需氨基酸以及磷酸鹽緩沖液(PBS)、3-(4，5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide (MTT試劑)均購于Sigma-Aldrich。

1.2 Mg-HA的制備

通過逐步化學沉淀反應一鍋法制備鎂摻雜的納米羥基磷灰石。250 mL燒瓶中加入10 mL濃度為 33.4 mmol·L-1的 Mg(NO3)2·6H2O 溶液，加入 1%(w/w)TME，磁力攪拌條件下加熱至85℃，緩慢滴加10 mL 濃度為 20 mmol·L-1的(NH4)2HPO4溶液。用濃氨水調節反應溶液的pH值為8.5左右。保持反應3 h后，向體系中滴加物質的量濃度為33.4 mmol·L-1的Ca(NO3)2·4H2O溶液，其中Ca與Mg的物質的量比控制為 1∶1、2.5∶1、5∶1 和 7.5∶1，反應 3 h 后再向體系中滴加濃度為20 mmol·L-1的(NH4)2HPO4溶液,保證(nCa+nMg)/nP=1.67。反應保持24 h，陳化12 h以上，用超純水去除多余的TME，冷凍干燥后得到Mg-HA。

1.3 Mg-HA的結構與性能表征

利用透射電鏡 (TEM，Tecnai G2 Spirit型，美國FEI公司)觀測樣品的形態和大小，工作電壓為120 kV。利用傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR，Nicolet 6700型，美國Nicolet公司)表征其化學結構；樣品用溴化鉀(KBr)壓片法制樣，透射模式檢測，檢測范圍為4 000～400 cm-1。 利用 X 射線衍射儀(XRD，D/max-2200/PC型，日本Rigaku公司)表征物相結構，檢測條件為銅靶(λ=0.154 05 nm)，電流 20 mA，電壓 40 kV，掃描速率 0.02°·s-1，掃描范圍：2θ=5°～80°。 樣品的比表面積和孔隙度通過比表面積孔隙度及化學吸附分析儀(ASAP 2010 M+C型，美國Micromeritics公司)檢測；樣品經過100℃除濕處理后，以Brunauer-Emmett-Teller(BET)模型分析計算樣品的比表面積數據，并通過脫附等溫線計算得到孔結構的數據。利用電感耦合等離子光譜發射光譜儀(ICP，iCAP6300型，美國 Thermo Fisher Scientific公司)定量分析樣品中Ca、Mg和P元素的含量；樣品的熱穩定性通過熱重分析儀 (TGA，Pyris1型，美國PerkinElmer儀器公司)檢測；稱取一定量的樣品，置于氧化鋁坩堝中，N2氣氛，檢測溫度范圍為40～900℃，升溫速率為 20 ℃·min-1。

1.4 Mg-HA/cDDP的制備與體外藥物緩釋性能評價

稱取 10 mg Mg-HA(nCa∶nMg=1∶1、2.5∶1、5∶1 和 7.5∶1)加入到5 mL PBS(pH=7.4)中超聲均勻分散。稱取15 mg順鉑(cDDP)溶于DMSO與PBS混合溶液中(VPBS∶VDMSO=4)，逐滴滴入 Mg-HA 分散液中，在 37 ℃條件下保持24 h使順鉑充分吸附在Mg-HA上；然后，離心分離、冷凍干燥后得到裝載順鉑的Mg-HA。用ICP測定鉑元素含量計算出上清液中未被吸附順鉑的濃度C1，已知初始的順鉑濃度為C0，溶液體積為V，載藥樣品總質量為m，裝載藥物質量為m0，則樣品的載藥量通過以下公式計算得出：

藥物緩釋效果測定：稱取4 mg Mg-HA/cDDP樣分散在2 mL PBS(pH=5.5或pH=7.4)中，并置于透析袋中 (截留分子量為1 kDa)。將透析袋置于30 mL pH=5.5或7.4的PBS(含2 mL DMSO助溶)中(37℃，12 000 r·min-1)， 分別在 0.25、0.5、1、2、4、8、12、24、48和72 h時取樣ICP檢測緩釋藥物，將透析袋外液體全部移除，重新加入30 mL PBS(含2 mL DMSO 助溶)，(pH=5.5 或 pH=7.4)。

載藥量與釋藥量測定數據是3組平行實驗結果的平均值。

1.5 細胞培養

實驗選用的L929(小鼠成纖維細胞)細胞系與HeLa(人宮頸癌細胞)細胞系購于中科院上海細胞庫。其培養方法如下：用含有10%(V/V)胎牛血清(FBS)、100 units·mL-1鏈霉素、100 units·mL-1青霉素的DMEM培養基進行細胞培養，置于75 cm2的培養瓶中貼壁生長。培養瓶置于溫度為37℃，含有5%CO2(V/V)的培養箱中培養，每隔2～3 d細胞進行傳代或實驗操作。

1.6 Mg-HA的體外細胞毒性

取對數生長期的L929細胞胰酶消化制成細胞懸液，使用DMEM培養基對細胞進行稀釋，細胞密度約為每毫升5×104個，小心接種于96孔板，每孔中加入200 μL細胞懸液，使每孔中含有約1×104個細胞。培養24 h，棄培養液，每孔加入50 μL一系列不同濃度的Mg-HA(PBS配制),濃度依次為0.3、0.6、1.25、2.5、5、10、20、40 和 80 μg·mL-1，每個濃度設置5個復孔，對照組加入等體積PBS，置于37℃、含有5%(V/V)CO2的培養箱中培養24、48和72 h后，吸出培養液，再加入PBS小心清洗96孔板2次后，每孔加入200 μL新鮮的DMEM培養基，然后加入用PBS配制的濃度為 5 mg·mL-1的 MTT溶液 20 μL，置于37℃培養箱中繼續孵育4 h，然后棄去培養液，每孔加入 150 μL DMSO，振板 10 min，通過酶標儀測490 nm波長的吸光度值。每組有6個平行孔(n=6)，實驗共重復3次。

1.7 Mg-HA/cDDP對HeLa細胞的生長抑制率

按1.6所述方法于96孔板中接種細胞培養24 h，分別加入50 μL Mg-HA/cDDP溶液，梯度濃度以順鉑濃度計算， 設為 0.3、0.6、1.25、2.5、5、10、20、40和 80 μg·mL-1，每個濃度設置 5 個復孔，對照組加入等體積PBS，置于37℃、含有5%(V/V)CO2的培養箱中培養24、48和72 h后，棄培養液，再用PBS小心清洗96孔板2次后，每孔加入200 μL新鮮的DMEM培養基，再加入用PBS配制的濃度為5 mg·mL-1的MTT溶液20 μL，置于培養箱中繼續孵育4 h，然后棄去培養液，每孔加入 150 μL DMSO，振板10 min，通過酶標儀測每孔在490 nm波長下的光密度值(Optical density，OD)，OD實表示實驗組 OD 平均值，OD空表示空白組OD平均值，根據公式計算細胞生長抑制率(η)。

對照組為單獨作用順鉑對HeLa細胞的生長抑制率。每組有6個平行孔(n=6)，實驗共重復3次。

2 結果與討論

2.1 形貌與尺寸分析

通過TEM能清楚觀察到不同投料物質的量比制得的鎂摻雜羥基磷灰石(nCa∶nMg=1∶1、2.5∶1、5∶1 和7.5∶1)的形貌和尺寸大小，以及鎂摻雜量對納米顆粒形態和尺寸的影響(圖1)。如圖1a所示，羥基磷灰石的形貌為長500～600 nm，直徑為50～100 nm的棒狀結構。摻雜鎂后的羥基磷灰石在形貌上與羥基磷灰石相比發生了較大變化(如圖1(b～e))，產物的尺寸為 300～400 nm，直徑約為 100～200 nm，外觀上有束狀納米纖維，呈稻草狀結構，在更高的放大倍數下 (圖1d′)，可以觀察到其束狀形態是由許多直徑10 nm左右的定向排列納米纖維組成；電子衍射圖譜中的衍射環清楚地表明其為各向異性的多晶結構。當投料比 nCa∶nMg=1∶1(圖 1b)，2.5∶1(圖 1c)時，其納米纖維并不明顯，隨著Mg比例的減小，當投料比nCa∶nMg=5∶1(圖 1d)，7.5∶1(圖 1e)時產物外觀上的纖維狀結構趨于明顯，并且產物形貌的均一性較好。

圖1 不同比例的鎂摻雜羥基磷灰石的TEM圖Fig.1 TEM images of Mg-HA particles synthesized at different feeding molar ratios

2.2 結構與性質分析

根據不同投料物質的量比所制得的Mg-HA的XRD衍射峰(圖2)與純羥基磷灰石的衍射峰相符合，并且隨著Mg在產物中的比例增加，產物的晶型的混亂度也有所增加，與文獻報道的規律相符合[25]。在投料物質的量比為2.5∶1時，可以明顯看到有雜質峰的存在，為Mg3(PO3)2·5H2O 前體導致[26]，說明在投料比為2.5∶1時，有部分Mg離子在被Ca離子替換出來后，未能繼續參與反應。其他不同投料比的條件下，由于雜質含量較低，并不能明顯觀測到雜質峰。

圖3是不同比例的Mg-HA的紅外吸收譜圖。譜圖中2 800～3 600 cm-1的寬峰以及1 635 cm-1左右的吸收峰是產物中的羥基或吸收空氣中的水的羥基O-H鍵振動吸收峰。1 430 cm-1處的峰是羰基C=O的吸收峰，表明了樣品在制備過程中，空氣中的CO2可能參與了反應，形成了碳酸根離子(CO32-)。927～1 160 cm-1處的單峰是由磷酸根離子(PO43-)中P-O的ν3伸縮振動造成的。497～608 cm-1處的雙峰則是由于磷酸(PO43-)的ν4彎曲振動造成的[27]。

圖2 不同比例的鎂摻雜羥基磷灰石的XRD圖Fig.2 XRD patterns of Mg-HA materials synthesized at different feeding molar ratios

圖3 不同比例的鎂摻雜羥基磷灰石的FTIR圖譜Fig.3 FTIR spectra of the Mg-HA materials synthesized at different feeding molar ratios

表1是不同比例的鎂摻雜羥基磷灰石的比表面積數據，其中羥基磷灰石的比表面積為43 m2·g-1，而不同投料物質的量比的鎂摻雜羥基磷灰石的比表面積均大于羥基磷灰石，約為2～3倍，這可能是受到其表面的大量納米纖維結構的影響，極大的增大了鎂摻雜羥基磷灰石的比表面積。

為了驗證最終產物中的Ca與Mg的含量是否與實際投料比相一致，用ICP來定量檢測樣品中Ca、Mg 和 P。結果如表 2 所示。所有產物中 nCa∶nMg的實際比值均大于投料比，分別為6.94，3.64，7.90，9.56(其對應的 nCa∶nMg=1∶1、2.5∶1、5∶1 和 7.5∶1)。 說明在反應過程中，被鈣離子置換出來的鎂離子有部分未能重新參與反應。 當 nCa∶nMg=5∶1，7.5∶1 時 Ca∶Mg 的實際比值較為接近。羥基磷灰石的nCa/nP的理論值為 1.67，當 nCa∶nMg=5∶1，7.5∶1 時，檢測出的(nCa+nMg)/nP的數值均接近于理論值，分別為1.64，1.67，此時產物中的實際鎂含量分別為2.26%和2.17%(w/w)。

通過不同投料比制得的 Mg-HA(nCa∶nMg=1∶1、2.5∶1、5∶1 和 7.5∶1)的熱穩定性熱失重曲線如圖 4 所示，隨著Mg在產物中的比例增加，樣品的熱穩定性也逐漸增加。在30～800℃的升溫范圍內，Mg-HA和HA的失重主要為表面吸附的水失重 (0～200℃，體中的晶格水失重(200～400℃)和羥基磷灰石中羥基的失重(600～800℃)[28]。所制得的Mg-HA的熱穩定性均較好，在30～800℃的升溫范圍內，失重均小于10%。

上述實驗結果表明，通過逐步反應一鍋法可以獲得這種形貌尺寸可控的鎂摻雜的納米羥基磷灰石。其離子置換的過程可能為：

圖4 TGA分析不同比例的鎂摻雜羥基磷灰石的熱穩定性Fig.4 Thermal stability of the Mg-HA materials synthesized at different feeding molar ratios

表1 不同比例的鎂摻雜羥基磷灰石的比表面積、孔徑、孔容數據Table 1 Specific surface area,pore volume,and average pore diameter of Mg-HA materials synthesized at different feeding molar ratios

表2 不同比例的鎂摻雜羥基磷灰石的元素Ca、Mg、P組成分析Table 2 Chemical analysis of Ca,Mg and P in Mg-HA materials synthesized at different feeding molar ratios

2.3 Mg-HA的體外細胞毒性

通過MTT法測定不同Ca和Mg的投料比制得的Mg-HA對L929細胞系的體外細胞毒性。結果如圖5所示，隨著Mg-HA濃度的增加和孵育時間的延長，材料對L929細胞系的毒性略有增加，但最終細胞存活率都保持在80%以上，結果表明所制得的鎂摻雜的納米羥基磷灰石對于L929細胞系的體外細胞毒性較低，具有較好的生物相容性。

圖5 不同投料比制得的鎂摻雜羥基磷灰石以不同濃度梯度與L929細胞共同培養不同時間后相對細胞活性的數據圖Fig.5 Relative cell activity of L929 cells against Mg-HAs synthesized at various feeding molar ratios compared with HA at different concentrations with different times

2.4 Mg-HA/cDDP的載藥量與釋藥量的結果分析

不同投料比制得的 Mg-HA(nCa∶nMg=1∶1、2.5∶1、5∶1和7.5∶1)的載藥量隨著鎂的比例的增加，載藥量有升高的趨勢，這與材料上的纖維狀的結構及其比表面積有關(圖 6)。 其中(nCa∶nMg=5∶1 的 Mg-HA 載藥量最高，為54.84%，所合成的Mg-HA的載藥量均大于羥基磷灰石HA的載藥量。

羥基磷灰石對于順鉑藥物的負載主要為吸附原理，Kawasaki[29]認為羥基磷灰石表面有2種吸附位置：① Ca位置：當羥基磷灰石表面為OH-時，該位置連著2個Ca2+，當在水溶液中，OH-至少在一瞬間空缺，該位置便形成了1個可吸附陰離子如PO43-、羧基等的吸附位置；②P位置：當羥基磷灰石表面為Ca原子時，該位置周圍連著6個O原子，在水溶液中，表面的Ca位置至少在一瞬間空缺，該位置便形成了1個可吸附陽離子如Sr2+、K+等的吸附位置。因此，在羥基磷灰石負載順鉑時，主要原理為順鉑中心的二價鉑通過該吸附原理吸附在羥基磷灰石的P位置。摻雜鎂元素后，會導致羥基磷灰石的結構缺陷，更有利于順鉑的吸附負載。

綜合上述物理化學性能表征的結果，以及載藥量的測試結果，我們選定投料比nCa∶nMg=5∶1制備的鎂摻雜羥基磷灰石(實際鎂含量為2.26%(w/w))作為研究對象進行后續的實驗研究。

圖6 不同比例的鎂摻雜羥基磷灰石對順鉑藥物的載藥量Fig.6 Drug loading rate of Mg-HA materials synthesized at different feeding molar ratios(nCa∶nMg)with cDDP in comparison with HA

圖7 為在pH=5.5和pH=7.4條件下測定Mg-HA/cDDP的藥物緩釋曲線。72 h后材料在pH=7.4和5.5時順鉑藥物累積釋放量分別達到29.77%和41.72%(w/w)。表明鎂摻雜羥基磷灰石對順鉑有一定的緩釋效果，在pH=5.5條件下藥物累積釋放量高于pH=7.4時，表明該負載藥物后的材料在腫瘤部位的微酸環境[30-32]中能有較好的藥物緩釋結果。

圖7 鎂摻雜羥基磷灰石(含2.26%鎂元素)在pH=5.5和7.4時的藥物緩釋曲線Fig.7 Drug releasing rate of Mg-HA(with 2.26%Mg)materials with cDDP at pH=5.5 and 7.4

2.5 Mg-HA/cDDP對HeLa細胞增殖的影響

圖8 鎂摻雜羥基磷灰石(含2.26%鎂元素)載順鉑后以不同濃度梯度(以順鉑計)與HeLa細胞共同培養后相對細胞活性的數據圖Fig.8 Relative cell activity of HeLa cells against Mg-HA/cDDP(with 2.26%Mg)at different concentrations for cDDP

如圖 8 所示，Mg-HA(nCa∶nMg=5∶1，實際鎂含量為2.26%)負載順鉑藥物后對HeLa細胞有明顯的生長抑制作用，隨著作用時間的增長，順鉑濃度的增加，對HeLa細胞增殖抑制作用也在增加。80 μg·mL-1載cDDP藥物的Mg-HA(以cDDP計)與細胞共孵育24和48 h后，細胞生長的抑制率分別為80.46%，87.79%。證明Mg-HA負載順鉑后能具有很好抑制癌細胞生長的效果。

如圖9所示，單獨作用順鉑對HeLa細胞有生長抑制作用。隨著作用時間的增長以及順鉑濃度的增加，對HeLa細胞的增殖抑制作用也變得顯著。80 μg·mL-1cDDP藥物與細胞共孵育 24、48和 72 h后，細胞生長的抑制率分別為78.43%、89.11%和88.65%。實驗結果與利用Mg-HA/cDDP作用于HeLa細胞對其的生長抑制率相一致，證明所制得的Mg-HA作為藥物載體不會影響抗癌藥物的藥效。

圖9 順鉑(cDDP)以不同濃度梯度與HeLa細胞共同培養后相對細胞活性的數據圖Fig.9 Relative cell activity of HeLa cells against cDDP at different concentrations

3 結 論

本研究使用了逐步反應步驟一鍋法合成了鎂摻雜的納米羥基磷灰石，通過調節Ca和Mg的投料比，能有效地調控Mg-HA的形貌和尺寸，其中當nCa∶nMg=5∶1 時，產物的形貌均一性較好，比表面積較大，有利于藥物的負載，此時所制得的Mg-HA中Mg的實際含量為2.26%。體外細胞毒性實驗表明所制備材料的體外細胞毒性較低，具有良好的生物相容性。選擇nCa∶nMg=5∶1的Mg-HA作為藥物載體負載抗癌藥物順鉑，載藥率為54.84%，載藥性能比HA有了較大提升，且在pH=5.5時，能有較好的藥物緩釋效果。材料負載藥物后仍能對HeLa細胞有較好的生長抑制效果，80 μg·mL-1藥物與細胞共孵育24和48 h后，細胞生長的抑制率分別為80.46%和87.79%，其結果與相同濃度與孵育時間條件下，單獨順鉑藥物與HeLa細胞作用的結果相一致。本文制備的鎂摻雜的納米羥基磷灰石能夠作為一種安全的藥物載體在生物醫藥領域等具有較好的應用前景。

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