秋水仙素誘導百合多倍體及流式細胞儀倍性鑒定研究

陳敏敏,周 音,孫億敬,李 心,張建軍*

（1上海市農業科學院林木果樹研究所，上海 201403；2臺州學院生命科學學院，臺州 318000）

百合（Lilium spp.）為百合科百合屬多年生球根植物，原產中國，主要分布于亞洲東部、歐洲、北美洲等北半球溫帶地區，全球已發現120個種以上，其中55種原產于中國。提高百合的觀賞性是目前種質資源創新的重要目標，多倍體育種技術能顯著增加花朵大小，增加葉片厚度，加深花瓣顏色，延長開花時間，從而提高花卉的觀賞性和商品價值［1］。目前，百合離體誘變育種的研究多集中在直接對實生苗進行化學試劑處理或對種子、未成熟胚［2］、鱗片、葉片采用秋水仙素處理，誘導再生小鱗莖或叢生苗［3-4］等方面，且再生途徑多為器官發生途徑，其不定芽再生率低，通過這一途徑獲得的百合誘變植株數量較少。相比之下，體細胞胚胎發生體系具有明顯優勢，可在短時間內獲得大量的再生植株，提高選擇基數，是離體化學誘變的優良再生體系。

流式細胞技術（Flow cytometer，FCM）是20世紀80年代興起的新技術，通過流式細胞分析儀對大量的處于分裂間期的細胞DNA含量進行檢測，然后經計算機自動統計分析，最后繪制出DNA含量（倍性）的分布曲線圖［5］。該方法不受植物體取材部位和細胞所處時期限制，可以是葉片、莖、根、花、果皮、種子等，也可以選取離體培養過程中的小植株或愈傷組織，組培苗葉片僅用1 cm2的樣品就可確定其倍性，且準確率高［6］。本研究以高效穩定的百合根體細胞胚胎發生體系為基礎，以秋水仙素為加倍劑，在已建立百合體細胞胚胎發生體系的基礎上創制觀賞百合新種質，并利用流式細胞技術鑒定百合倍性，在優化細胞裂解液、濾膜目數、離心次數、材料來源的基礎上，結合形態學、解剖學等常規方法，對經秋水仙素誘導處理的觀賞百合再生植株進行倍性鑒定，為百合科植物多倍體誘導及鑒定提供參考，同時為百合新品種選育提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為東方百合品種 ‘索邦’（Sorbonne）（2n=2x=24）和‘康卡多’（Concad’Or）（3n=3x=36）［7］。

1.2 試驗方法

1.2.1 百合多倍體誘導處理

以本實驗室前期獲得的百合品種‘索邦’的胚性愈傷組織［8］作為誘導加倍材料，將胚性愈傷組織用0.1 mg/L、0.25 mg/L、0.5 mg/L的秋水仙素分別處理24 h和48 h，無菌水沖洗3次，將愈傷組織接種于添加1.0 mg/L Picloram和0.5 mg/L 6-BA的MS培養基上，待其發育為成熟的子葉型胚時，將子葉型胚接種于含0.1 mg/L CPPU［N-（2-chloro-4-pyridyl）-N’-phenylurea］的 MS培養基上培養，發育為完整植株。組織培養條件均為溫度25℃，光照強度2 500 lx，光照時間12 h。每處理至少接種2瓶，每瓶接種10個外植體，每處理重復3次，統計再生率。

1.2.2 多倍體的篩選與鑒定

1.2.2.1 形態、氣孔及染色體鑒定

再生植株形態學鑒定以二倍體材料為對照，根據其葉型、植株形狀、株高等指標初步判斷。

解剖學鑒定根據氣孔指標，具體方法為：用蒸餾水清洗成熟葉片，干燥后，用尖頭鑷子輕輕撕下表皮，并將其置于加蒸餾水的載玻片上，使其平整，置于顯微鏡下觀察。根據固定視野內的氣孔數量來判斷是否加倍。

染色體鑒定采用根尖壓片法［4］，具體方法如下：取百合組培苗幼嫩根尖2—3 mm，洗凈后在0.1%的秋水仙堿溶液中預處理24 h；無菌水沖洗3—5次后，加入新配制的卡諾固定液（3∶1的純酒精∶冰醋酸溶液），于4℃冰箱固定12 h；無菌水沖洗干凈后用1 mol/L的HCL在60℃下解離5—8 min，無菌水沖洗干凈；用醋酸洋紅染色后壓片觀察。

1.2.2.2 流式細胞儀倍性鑒定條件的優化

解離液：分別采用 OTTO’s buffer［9］、WPB buffer［9］、Galbraith’s buffer［9］、Kiwifruit buffer［10］4種解離液制備葉片細胞核懸液，比較試驗效果，具體成分如表1所示。

在模型分析過程中，相較于以往的CAD繪制，BIM技術可以創建虛擬建筑模型，進而對建筑進行智能化分析，而且在虛擬建筑模型中還涵蓋著豐富的非圖形數據信息，對其數據進行相應的分析，即可實現對建筑物結構、能量、工程量等各方面數據的準確信息，進而獲得對建筑物全方面的認識，從而確定最優的建筑設計方案，實現對建筑工程施工的全方位控制。通過BIM技術運用可以有效規避人為因素的影響，從而保證工程信息與建筑設計方案的一致，為后續的施工工作提供準確的方案指導，進而推動建筑工程項目的順利完成。

表1 細胞核解離液組成成分Table 1 Com ponents of nuclear dissociation solution

提取方法：（a）在直徑6 cm的玻璃培養皿中加入0.1—0.15 g葉片（組培苗新葉或溫室材料老葉），滴加1.0—1.5 mL細胞核提取液，用鋒利刀片一次性快速切碎葉片至糊狀（整個過程中，材料須浸沒在解離液里，以便更好地游離細胞核），用尼龍網濾膜（300目、400目、500目）過濾到1.5 mL離心管中，濾液保持在1.0 mL左右，置于4℃冰箱5 min。（b）取出樣品在4℃下1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入600μL解離液與60μL預冷PI染色液于4℃避光染色15 min。（c）利用Beckman Colour流式細胞儀檢測，將樣品移至上樣管上機檢測。

選擇不同倍性材料（二倍體和三倍體）、不同解離液（OTTO’s buffer、WPB buffer、Galbraith’s buffer、Kiwifruit buffer）、不同濾膜目數（300目、400目、500目）、不同離心方式（不離心、離心1次或離心2次），研究不同條件對出峰效果的影響。

1.2.2.3 再生植株加倍率的統計

每種處理的再生植株隨機抽取10—15株進行倍性鑒定，每處理重復3次，結合氣孔鑒定、染色體壓片和流式細胞儀3種方法確定加倍率。

加倍率=（每種處理加倍植株總數/接種外植體數）×100%

1.3 數據分析

試驗數據采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析（ANOVA）。

2 結果與分析

2.1 流式細胞儀倍性鑒定條件的優化

2.1.1 不同倍性百合葉片對出峰效果的影響

溫室種植的‘索邦’和‘康卡多’經Kiwifruit解離液解離和400目濾網過濾，1次離心條件下的流式細胞出峰效果如圖1所示?！靼睢占毎麛颠_10 000以上且計數速度快；‘康卡多’收集有效顆粒數在5 000左右，計數速度較‘索邦’慢，且雜峰高。以上結果表明：不同倍性材料對出峰效果影響明顯，二倍體較三倍體材料通過速度快、雜質少。

圖1 不同倍性百合葉片對出峰效果的影響Fig.1 Effects of different ploidy lily leaves on peak values

2.1.2 不同解離液對出峰效果的影響

如圖2所示，使用OTTO’s buffer雜質多，雜質峰高，樣品峰前部分受到雜質峰的影響，很難收集到上千個細胞核數據，基本沒有主峰。熒光顯微鏡下觀察發現，大部分為碎片，完整的細胞核較少，表明其不能很好地裂解細胞；WPB buffer雖能收集夠有效細胞核，但細胞核破裂情況明顯，碎片峰明顯高于主峰，說明其也不適用于百合葉片的解離；Galbraith’s buffer和 Kiwifruit buffer對百合葉片都有較好的裂解效果，主峰明顯，細胞核多，染色效果好，G2峰明顯，其中使用Kiwifruit buffer解離液雜質峰小，雜質有效減少，熒光通道值在200道的出峰明顯，并且堵塞機器明顯緩解；使用Galbraith’s buffer雖不堵管，但是雜質峰較Kiwifruit buffer高。相比之下Kiwifruit buffer效果略優于Galbraith’s buffer。綜合考慮4種解離液的效果，Kiwifruit buffer最適合百合葉片進行流式細胞儀鑒定倍性。

2.1.3 不同濾膜目數對出峰效果的影響

如圖3所示，不同濾膜目數對出峰效果影響不大，都能明顯看到G2期（DNA合成后期，DNA已加倍）。

圖2 不同解離液對出峰效果的影響Fig.2 Effects of different dissociation solution on peak values

圖3 不同濾膜目數對出峰效果的影響Fig.3 Effects of different filter mesh on peak values

2.1.4 不同離心次數對出峰效果影響

離心與不離心對出峰效果有較大影響。由圖4可以看出，不離心雜質比1次離心多，且儀器出現堵管現象，G2期較1次離心明顯；1次離心和2次離心差別不明顯，儀器未出現堵管現象，且均能看到G2期。綜合考慮，選擇1次離心。

圖4 不同離心次數對出峰效果的影響Fig.4 Effects of different centrifugation times on peak values

2.1.5 溫室葉片與組織培養葉片對出峰效果影響

結果表明：組培新葉和溫室老葉在熒光通道值為200道時均出現明顯的主峰，但組培新葉效果略優于溫室老葉。如圖5所示，溫室老葉的樣品碎片峰明顯高于組培新葉（50—100道附近），因此在流式細胞儀檢測時應盡量選取幼嫩的組織材料。

2.2 百合胚性愈傷組織誘導加倍效果

圖5 溫室葉片與組培葉片對出峰效果的影響Fig.5 Effect of leaves in the greenhouse and tissue-culture condition on peak values

經過秋水仙素處理的胚性愈傷組織部分褐化死亡，未褐化死亡的胚性愈傷組織0 d左右開始發育成球形胚，并陸續長成完整植株。由表2可以看出，0.1 mg/L的秋水仙素處理24 h植株再生率最高，為49.78%，但未獲得加倍植株。隨著秋水仙素濃度的提高和處理時間的延長，植株的再生率明顯下降，0.5 mg/L處理48 h時再生率最低，只有12.21%；但再生植株的加倍率隨著處理濃度的提高和時間的延長明顯增加，0.5 mg/L秋水仙素處理24 h時植株的加倍率最高，達到12.14%。以上結果表明，低濃度秋水仙素處理時誘變率低，高濃度秋水仙素短時間處理誘變效果相對較好，秋水仙素在一定濃度范圍和處理時間內均可獲得加倍植株。

表2 不同濃度秋水仙素和處理時間對植株再生和染色體加倍的影響Table 2 Effects of different colchicine concentration and treatment time on plant regeneration rate and chromosome doubling rate

2.3 百合再生植株形態、氣孔及染色體鑒定

經加倍處理的部分百合再生植株在形態上發生了明顯的變異，株高較正常植株矮，葉片顏色加深并肉質化加厚（圖6A、B）。對這些形態發生變異的植株繼續進行氣孔觀察，發現變異植株氣孔明顯變大，單位面積內的氣孔數量明顯減少（圖6C、D）；對其進行染色體計數觀察發現，二倍體‘索邦’染色體數目增加（圖6E、F）；對其進行流式細胞儀鑒定（二倍體為對照），發現其為四倍體百合（圖7）。

圖6 不同倍性百合組培苗、氣孔及染色體Fig.6 Tissue culture seed lings，stomata and chromosomes of different p loidy lily

圖7 百合加倍材料流式細胞儀鑒定Fig.7 Identification of lily doubling material by flow cytometry

3 討論

植物體細胞胚的發生多是單細胞起源，具有繁殖率大、嵌合體少、無性系變異小等優點，是誘變育種研究及轉基因研究的優良再生體系。如張清國等［11］采用秋水仙素誘導落葉松體細胞胚再生建立了多倍體體細胞胚再生體系，并獲得大量多倍體個體。傳統的方法采用秋水仙堿處理種子或鱗莖外植體誘導多倍體易產生嵌合體。如楊英杰等［12］采用秋水仙堿處理細葉百合的種子獲得了49株形態變異植株，經染色體倍性鑒定，有47株為染色體倍性發生變化的變異植株，其中有6株為四倍體，1株為三倍體，其余為染色體非整倍體變異植株。王麗艷等［13］采用秋水仙堿處理蘭州百合帶小鱗莖的鱗片所獲得的植株也存在一定的嵌合體。本研究采用百合根外植體誘導獲得的胚性愈傷組織作為誘導加倍材料，不僅獲得了大量的再生植株，而且在材料的倍性鑒定中未發現嵌合體，這一再生體系可顯著提高染色體加倍的成功率。本研究發現，隨著秋水仙素處理濃度的增加和處理時間的延長，胚性愈傷的死亡率和相對誘變率均得到提高，但處理濃度過高或處理時間過長，胚性愈傷成苗率大大降低，很難獲得誘變植株，而且在恢復生長時存在能力減弱、植株生長緩慢的現象。

細胞解離液是流式細胞技術鑒定植物倍性的關鍵。植物細胞解離液的組成成分不僅與熒光分辨率有關，而且還會影響細胞核從細胞質中的釋放、分離后細胞核的完整性及DNA的染色。根據前人分析結果，細胞碎片產生的主要原因是植物細胞的自身結構［9］。植物細胞由于有細胞壁使得細胞有不規則形狀，且細胞中的NADH和核黃素等使細胞產生自發熒光，均會影響待測樣本的液流［9］。此外，細胞核解離液與待測植物樣本不匹配也會導致碎片峰增多。雖然不同的解離液在組分上基本都含有細胞核染色質穩定劑、核酸酶活性抑制劑、緩沖液pH穩定劑等，但各裂解液不同組分在濃度上差異較大，當裂解液不適合時，不僅不能保持細胞核的完整性，還會加速細胞核的破裂［14］。吳青青等［15］采用CyStain UV Precise T提取液和WPB裂解液對百合花粉和葉片進行裂解，發現CyStain UV Precise T提取液明顯優于WPB裂解液，WPB裂解液的碎片峰較高，與本研究采用WPB裂解液得到的結論一致。經對比選擇，本研究最適合百合葉片的細胞裂解液為Kiwifruit buffer。此外，溫室種植的百合葉片效果差于組培苗葉片。前人也采用流式細胞技術鑒定百合倍性［2，16］，但未針對流式細胞儀倍性鑒定的因素進行詳細優化，本試驗對流式細胞儀鑒定百合倍性的影響因素進行了優化，可為百合科植物染色體倍性鑒定提供參考。

本研究對形態鑒定法、流式細胞儀法、染色體計數法3種鑒定方法進行比較，發現形態鑒定法最直觀簡單，但存在較大的不確定性；流式細胞儀檢測方法在優化好條件后簡單、準確性高，適合短時間內鑒定大批量樣品，但費用較高；染色體計數法準確性最高，但步驟復雜，檢測時間長。結合3種方法的優缺點，對大批需鑒定倍性的植物材料可以先從形態學初步判定，之后采用流式細胞儀鑒定，確定加倍后再采用染色體計數的方法最終確定材料倍性。

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