NMHC-ⅡA在PRRSV感染M arc-145細胞過程中的作用

李 紅,劉成倩,孫鳳萍,高 駿,易建中*

（1上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海 201106；2上海佳牧生物制品有限公司，上海 201106）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由PRRS病毒（PRRSV）感染所致的一種接觸性傳染病，主要表現為母豬發熱、厭食、流產、早產、木乃伊胎、弱仔等繁殖障礙及仔豬和豬呼吸系統疾病［1-3］。已公布的 PRRSV受體中，存在于豬肺泡巨噬細胞（Porcine alveolar macrophages，PAM）的 3個受體分別為硫酸乙酰肝素 （Heparin sulfate，HS）［4-5］、唾液酸黏附素（Sialoadhesin，Sn）［5-6］和清道夫受體 CD163［7］，存在于 PRRSV易感染細胞系 Marc-145上的受體為 CD151和波形蛋白（Vimentin）［8-9］。目前，PRRSV與受體之間相互作用的分子機制還不完全清楚，普遍認為HS能夠調節低水平病毒的吸附，但并不能將病毒內吞。Sn能夠調節病毒的吸附和內吞，但并不能將病毒內吞，且不需要硫酸乙酰肝素的協助。CD163受體的作用可能是協助唾液酸黏附素內吞、PRRS病毒脫衣殼以及基因組RNA的釋放［10］。

存在于非肌肉細胞中的肌肉蛋白II稱為非肌肉肌球蛋白Ⅱ（Non-musclemyosinⅡ，NMⅡ），其與肌動蛋白結合構成細胞中的分子馬達［11-12］。研究發現，NMⅡ在囊泡的轉移和釋放、細胞吞飲、病毒入侵等方面也有一定的作用［13-14］，但NMⅡ其他功能研究較少。非肌肉肌球蛋白重鏈Ⅱ型（Non-muscle myosin heavy chain-Ⅱ，NMHC-Ⅱ）廣泛分布在生物體內，參與細胞遷移、黏附、胞質分裂等各種生理活動［15］。NMHC-Ⅱ有NMHC-ⅡA、NMHC-ⅡB、NMHC-ⅡC 3種不同的亞型，它們具有相似的結構，均為由一對大小為171—244 ku的重鏈和兩對大小為16—23 ku的輕鏈組成的六聚體，其中NMHC-ⅡA的重鏈大小為230 ku［16］。2008年周恩民等［17］首次提出NMHC-ⅡA可能是PRRSV的受體或輔助因子，為了進一步研究該蛋白在PRRSV感染宿主細胞中的作用，本試驗以NMHC-IIA為研究對象，探討其與CD163受體的關系以及在PRRS病毒感染過程中的定位。

1 材料與方法

1.1 細胞、毒株、抗體以及試劑

Marc-145細胞系為本實驗室保存；PRRSV 12#毒株（GenBank：HQ416720）、抗PRRSV N蛋白的單克隆抗體（6D10）以及PRRSV陽性豬血清（345#）為山東農業大學免疫生物學實驗室提供；抗PRRSV GP5抗獨特型抗體Mab2-5G2由西北農林科技大學周恩民教授提供；二抗HRP-羊抗豬IgG和FITC-標記羊抗鼠IgG購自Jackson公司；G-cy5標記的羊抗鼠二抗購自SoutherBiotech公司；Vectashield包埋試劑購自Vector labs公司；其他常規試劑均為國產分析純。

1.2 免疫共沉淀提取NMHC-ⅡA

將Marc-145細胞從細胞培養瓶上輕輕刮下，3 000 r/min離心10min，收集細胞，PBS緩沖液（0.01mol/L，pH 7.2）重懸細胞，洗滌3次，使細胞達4×107個左右。加入RIPA細胞裂解液［18］1 mL重懸細胞，放入-70℃冰箱反復凍融裂解細胞3次，轉入4℃搖床上輕搖30 min，離心，收集上清液，并加入50μL用RIPA洗滌3次的Resin，放入4℃搖床上輕搖1 h，離心，收集上清，加入5μLMab2-5G2（11 mg/mL），4℃輕搖孵育14—16 h，加入Resin 50μL，4℃輕搖孵育4 h，離心，收集沉淀物，加入1 mL RIPA洗滌沉淀，離心，棄上清，洗滌3次。取Resin 10μL于試管中，進行SDS-PAGE檢測。

1.3 SDS-PAGE蛋白電泳檢測NMHC-ⅡA

參照分子克隆實驗指南操作制備8%分離膠和5%積層膠，進行凝膠染色和脫色［19］。按照電泳裝置的使用說明，裝好潔凈干燥的玻璃板，灌膠、電泳。

1.4 W estern Blot檢測NMHC-IIA

按照1.3 SDS-PAGE的步驟制備凝膠及電泳。將分離膠放入電轉緩沖液中，按照實驗室常規半干轉膜法轉PVDF膜［19］。取出的膜放入含2.5%脫脂奶粉的PBST中，封閉1 h。將膜放入含有Mab2-5G2的抗獨特型抗體中，孵育1 h。PBST洗滌3次，每次5 min。PVDF膜放入HRP標記羊抗鼠的二抗中孵育1 h。PBST洗滌3次，每次5 min。將膜放入底物中顯色，用去離子水終止反應。

1.5 NMHC-IIA與PRRSV的檢測

按照2×105個/mL含量培養Marc-145細胞于含有蓋玻片的細胞培養板內，24 h后，100μL細胞液接入100 TCID50的PRRSV，細胞板轉入4℃孵育1 h，然后放入37℃、5%CO2培養箱內培養不同時間，分別于 0 min、5 min、10 min、15 min、30 min、60 min、90 min、120 min用預冷的 75%乙醇 4℃固定 30 min，棄去細胞板內乙醇，超凈工作臺內吹干。固定細胞于0.5%TritonX-100，室溫處理5 min，PBS洗滌3次，每次5 min。加入阻斷緩沖液［18］，室溫放置1 h，PBS洗滌3次，每次5min。細胞按照一定稀釋度加入Mab2-5G2（1 mg/mL）和PRRSV陽性豬血清345#（1∶160），室溫孵育1 h，PBS洗滌3次。將稀釋好的G-cy5標記的羊抗鼠和FITC標記的羊抗豬二抗（G-cy5-羊抗鼠IgG：1μg/106個細胞，FITC-羊抗豬IgG：1μg/106個細胞）加入到細胞上，室溫孵育1 h，PBS緩沖液洗滌3次。將細胞板內蓋玻片取出，將蓋玻片上細胞包埋在Vectashield包埋試劑中，用指甲油包封閉蓋玻片，于激光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照。

1.6 NMHC-IIA與CD163片段的相互作用

將按照1.2方法提取的NMHC-IIA蛋白進行SDS-PAGE，然后轉入PVDF膜，將轉好的膜放于2.5%脫脂奶粉中4℃孵育過夜。膜用0.5%PBST洗滌3次，每次10 min，加入純化的M1、M2、M3蛋白［20］，室溫孵育2 h，用0.5%PBST洗滌3次，每次10 min。加入Mab2-5G2或抗HIS標簽的單克隆抗體，室溫孵育2 h后，洗滌3次，每次10 min。加入羊抗鼠-HRP標記的二抗，室溫孵育1 h后，加入增強型HRP-DBA底物顯色液進行檢測。

2 結果與分析

2.1 NMHC-ⅡA蛋白的提取與檢測

通過免疫共沉淀技術獲得beads-5G2-NMHC-ⅡA蛋白復合物，將此蛋白復合物洗脫、中和，獲得純化的NMHC-ⅡA蛋白，取適量NMHC-ⅡA蛋白進行SDS-PAGE電泳。如圖1所示，NMHC-ⅡA蛋白大小為230 ku。

2.2 NMHC-IIA與PRRSV感染關系

圖1 SDS-PAGE檢測M arc-145細胞中NMHC-IIAFig.1 Detection of NMHC-IIA in M arc-145 cells by SDS-PAGE

分別通過綠色和紅色熒光二抗（FITC-標記的羊抗豬和CYTM5-標記的羊抗鼠）檢測在PRRSV感染Marc-145細胞時，NMHC-ⅡA蛋白在細胞中的位置和表達量。通過激光共聚焦顯微鏡發現：將細胞轉入4℃時，PRRS病毒主要分布在被感染細胞表面，當細胞從4℃轉入37℃時，PRRS病毒在5 min左右進入細胞。隨著病毒感染細胞時間的延長，NMHC-ⅡA蛋白在Marc-145細胞內的表達量增加；當PRRS病毒完全進入被感染細胞后，NMHC-ⅡA的表達量減少（圖2）。

圖2 NMHC-ⅡA蛋白在PRRSV感染M arc-145細胞中的分布和表達量Fig.2 Distribution and expression of NMHC-ⅡA protein in M arc-145 cells infected with PRRSV

2.3 NMHC-ⅡA蛋白與CD163蛋白的相互作用

將純化的NMHC-ⅡA蛋白與CD163分段蛋白（M1、M2、M3）孵育1 h后，經免疫共沉淀試驗發現：NMHC-ⅡA蛋白與M1和M3蛋白能夠相互作用，與M2蛋白沒有相互作用（圖3）。

圖3 Western Blot檢測NMHC-ⅡA和CD163片段的相互作用Fig.3 Detection of interaction between NMHC-ⅡA and CD163 fragments by Western Blot

3 討論與結論

目前，PRRSV感染致病機制尚不清楚。病毒感染宿主細胞，主要是通過與細胞表面的特異性受體結合，利用細胞的內吞作用感染易感細胞。PRRSV感染易感細胞系非洲綠猴腎細胞Marc-145的過程也是通過細胞表面的受體進行的，但已有報道稱Marc-145細胞系上沒有Sn受體［21］。PRRSV能夠感染Marc-145細胞，說明PRRSV可能與Marc-145細胞上的其他受體或者輔助因子相互作用繼而引起PRRSV感染和進入細胞。Kim等［22］研究發現，波形蛋白存在于Marc-145細胞表面，并能夠與PRRSV的N蛋白相互作用，說明波形蛋白參與PRRSV感染Marc-145細胞的過程。周恩民等［17］通過免疫共沉淀技術，利用PRRSV結構蛋白GP5的單克隆抗獨特型抗體Mab2-5G2，從PAM和Marc-145細胞中提取獲得非肌肉肌球蛋白重鏈ⅡA（NMHC-ⅡA）。本研究發現，Marc-145細胞上的PRRSV受體CD163與NMHC-ⅡA蛋白能夠相互作用，作用位點主要集中在CD163蛋白的M1（20—259 aa）和M3（714—1 040 aa）蛋白上。同時，通過激光共聚焦顯微鏡定位發現，NMHC-ⅡA蛋白在PRRSV感染細胞過程中隨著感染時間的延長和病毒感染量的增加，其表達量也有所增加。本試驗認為，NMHC-ⅡA蛋白可能在PRRSV感染Marc-145細胞過程中發揮協同作用。本研究進一步揭示了PRRSV受體或協同因子之間的相互作用，對PRRSV感染致病機制有一定的促進作用。后期可以進一步縮短結合蛋白的長度，找到相互作用位點，利用RNAi技術敲除結合位點，從而減少病毒侵染宿主細胞的機會。

［1］WENSVOORT G.Lelystad virus and the porcine epidemic abortion and respiratory syndrome［J］.Vet Res，993，24（2）：117-124.

［2］MEULENBERG J J.PRRSV，the virus［J］.Vet Res，2000，31（1）：11-21.

［3］GREBENNIKOVA T V，CLOUSER D F，VORWALD A C，et al.Genomic characterization of virulent attenuated，and revertant passages of a North American porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain［J］.Virology，2004，321（2）：383-390.

［4］DELPUTTE P L，VANDERHEIJDEN N，NAUWYNCK H J，et al.Involvement of thematrix protein in attachment of porcine reproductive and respiratory syndrome virus to a heparinlike receptor on porcine alveolarmacrophages［J］.JVirol，2002，76（9）：4312-4320.

［5］DELPUTTE P L，COSTERS S，NAUWYNCK H J.Analysis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus attachment and internalization：distinctive roles for heparan sulphate and sialoadhesin［J］.JGen Virol，2005，86（Pt5）：1441-1445.

［6］VANDERHEIJDEN N，DELPUTTE P L，FAVOREEL H W，et al.Involvement of sialoadhesin in entry of porcine reproductive and respiratory syndrome virus into porcine alveolarmacrophages［J］.JVirol，2003，77（15）：8207-8215.

［7］CALVERT JG，SLADE D E，SHIELDS S L，et al.CD163 expression confers susceptibility to porcine reproductive and respiratory syndrome viruses［J］.JVirol，2007，81（14）：7371-7379.

［8］KIM JK，FAHAD A M，SHANMUKHAPPA K，et al.Defining the cellular target（s）of porcine reproductive and respiratory syndrome virus blockingmonoclonal antibody 7G10［J］.JVirol，2006，80（2）：689-696.

［9］SHANMUKHAPPA K，KIM JK，KAPIL S.Role of CD151，A tetraspanin，in porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection［J］.Virol J，2007，4：62.

［10］DELPUTTE P L，NAUWYNCK H J.Porcine artervirus entry in macrophage：heparin sulfate-mediated attachment，sialoadhesin-mediated internalization，and a cell-specific factormediating virus disassembly and genome release［J］.Adv Exp Med Bio，2006，581：247-252.

［11］SIMONSM，WANG M，MCBRIDE O W，et al.Human nonmuscle myosin heavy chains are encoded by two genes located on different chromosomes［J］.Circ Res，1991，69（2）：530-539.

［12］BERG JS，POWELL B C，CHENEY R E.A millennialmyosin census［J］.Mol Biol Cell，2001，12（4）：780-794.

［13］SEABROOKE S，QIU X，STEWART B A.Nonmuscle myosinⅡ helps regulate synaptic vesicle mobility at the Drosophila neuromuscular junction［J］.BMC Neurosci，2010，11：37.

［14］DOREIAN BW，FULOP T G，SMITH C B.MyosinⅡ activation and actin reorganization regulate the mode of quantal exocytosis in mouse adrenal chromaffin cells［J］.JNeurosci，2008，28（17）：4470-4478.

［15］VICENTE-MANZANARESM，MA X，ADELSTEIN R S，et al.Non-musclemyosinⅡ takes centre stage in cell adhesion and migration［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2009，10（11）：778-90.

［16］GOLOMB E，MA X，JANA SS，et al.Identification and characterization of nonmusclemyosin II-C，a new member of themyosin II family［J］.J Biol Chem，2004，279（4）：2800-2808.

［17］ZHOU E M，XIAO Y，SHIY，etal.Generation of internal imagemonoclonal anti-idiotypic antibodies against idiotypic antibodies to GP5 antigen of porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］.JVirol Methods，2008，49（2）：300-308.

［18］李紅.CD163及其他蛋白在PRRSV感染細胞過程中的相互作用［D］.泰安：山東農業大學，2011.

［19］J薩姆布魯克，DW拉塞爾.分子克隆實驗指南［M］.3版.北京：科學出版社，2002.

［20］李紅，劉成倩，易建中.PRRSV受體CD163與Marc-145細胞的相互作用［J］.中國獸醫學報，2016，36（8）1273-1277.

［21］DUAN X，NAUWYNCK H J，FAVOREEL HW，etal.Identification of a putative receptor for porcine reproductive and respiratory syndrome virus on porcine alveolarmacrophages［J］.JVirol，1998，72（5）：4520-4523.

［22］KIM H S，KWANG J，YOON I J，et al.Enhance replication of porcine reproductive and respiratory syndrome（PRRSV）virus in a homogeneous subpopulation of MA-104 cell line［J］.Arch Virol，1993，133（3/4）：477-483.