不同品種群牡丹表型SSR標記的遺傳多樣性及聚類分析

郭麗麗,李明月,郭大龍,馬慧麗,張麗霞,侯小改*

（河南科技大學農學院/牡丹學院，洛陽 471023；河南科技大學林學院，洛陽 471023）

牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）是芍藥科芍藥屬牡丹組落葉灌木，集藥用價值、觀賞價值和油用價值于一身。牡丹加工而成的丹皮是重要的中藥材，牡丹種子具有抗癌、抗氧化、抑菌、消炎、止痛之功效［1-2］。牡丹籽油富含亞麻酸、亞油酸、油酸等不飽和脂肪酸，同時富含藥用牡丹有效成分，具有降血糖、降血脂、降膽固醇、增強免疫力等醫療保健功效［3］。

中國是世界牡丹的發祥地和世界牡丹王國，有著豐富的牡丹野生種質及品種資源［4］，現已形成由17個品種群構成的復雜體系，包括各色各花型牡丹栽培品種2 000多個［5］，分為革質花盤亞組和肉質花亞組。革質花盤亞組包括牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）、矮牡丹（Paeonia jishanensis T.Hong et W.Z.Zhao）、卵葉牡丹（Paeonia qiui Y.L.Pei et D.Y.Hong）、楊山牡丹（Paeonia ostii T.Hong et J.X.Zhang）、紫斑牡丹（Paeonia rockii T.Hong et J.J.Liet D.Y.Hong）和四川牡丹（Paeonia decomposita Hand.-Mazz）；肉質花亞組包括紫牡丹（Paeonia delavayi Franch.）、狹葉牡丹（Paeonia potanini kom.）、黃牡丹（Paeonia lutea Delavay et Franch）和大花黃牡丹（Paeonia ludlowii Hong）［6］。在長期馴化栽培過程中，形成了數量眾多的牡丹栽培品種，其雜交后代顏色豐富，花期較晚且長，豐富了牡丹的遺傳變異。由于牡丹分類地位不斷更新，新品種不斷開發，遺傳背景及品種間親緣關系尚不清楚，造成對其種質資源遺傳多樣性的研究愈加困難［7］。

采用分子標記鑒定方法可提早預測雜交幼苗的表現性狀，縮短育種年限，鑒定品種間的親緣關系，分析牡丹種質資源的遺傳多樣性［8］。科研工作者利用RAPD（Random amplified polymorphic DNA）［9］、AFLP（Amplified fragment length polymorphism）［10］、SRAP（Sequence related amplified polymorphism）［11］、cpDNA［12］、SSR（Simple sequence repeat）［13-14］、CDDP（Conserve DNA-derived polymorphism）［15］、核 DNA與葉綠體 DNA分子標記［16］、ISSR（Innter-simple sequence repeat）［17］等分子標記技術對牡丹種和栽培品種群的遺傳多樣性進行了研究，但研究結果并不完全一致，這可能是由于在研究過程中使用了不同的試驗材料以及所選擇的樣本數量和分子標記的種類不同所致。

以SSR為代表的第二代分子標記成為牡丹中最重要的分子標記類型［18］。SSR是真核生物基因組基因編碼區和非編碼區廣泛分布的序列較短且重復出現的核苷酸序列，通過特異性引物對SSR兩端相對保守的單拷貝序列進行PCR擴增和聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，因重復序列數目或重復程度不同而呈現多態性［19］，具有多態性豐富、突變率高、重復性好、共顯性和操作簡便等優點［8］。前人對牡丹SSR標記進行了開發，并廣泛應用于牡丹遺傳多樣性研究、種質鑒定、栽培種質起源與關系分析、遺傳圖譜構建、分子標記輔助育種、組培后代遺傳穩定性研究等方面［13-14，20-31］。牡丹SSR分子標記的開發與應用，可為推動牡丹分子標記輔助選擇育種，提高育種效率奠定良好基礎［18］。

由于牡丹基因組龐大且非常復雜，盡管對SSR標記進行了大量開發，但是尚不能達到覆蓋全基因組的水平，且在牡丹中經驗證的有效SSR標記相對有限，其能夠應用于品種DNA指紋圖譜和分子標記輔助選育的數量仍相對有限，限制了SSR分子標記技術在牡丹育種中的應用。本研究采用自主開發的SSR標記對不同品種群牡丹進行遺傳多樣性分析，以期獲得可用于牡丹種源鑒定的有效SSR標記，為牡丹遺傳圖譜構建及分子標記輔助育種奠定理論和技術基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為分別來自中原、國際、西南、西北、江南牡丹品種群的30個品種（表1），樣品均取自國際牡丹園。采集各品種春季剛長出的、自上往下數第3—4片新鮮葉片，迅速置于液氮中冷凍后，帶回實驗室置于-70℃冰箱中保存備用。

1.2 SSR引物開發

試驗所用SSR引物均為自主開發，采用HiSeq2000高通量測序儀對中原牡丹品種‘洛陽紅’和‘烏龍捧盛’進行測序，使用 MicroSAtellite（MISA，http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）發掘 SSR位點，使用Primer3對獲得的SSR進行引物設計，隨機挑選22對引物（表2）進行不同品種群牡丹SSR標記的遺傳多樣性及聚類分析。

1.3 基因組DNA提取與PCR擴增

采用百泰克植物基因組DNA提取試劑盒提取牡丹基因組DNA，紫外分光光度計定量DNA，各品種隨機選取5份DNA樣品等量混合用于 PCR擴增。PCR反應體系：正反引物各0.5μL（10μmol/L），ddH2O 3μL，DNA 1.0μL（20 ng/μL），Premix 5μL（TaKaRa）。PCR反應程序：94℃ 3 min；94℃ 30 s，54℃30 s，72℃1 min，30個循環；72℃10 min。取擴增產物2μL進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，選取具有多態性的位點，剩余產物通過8%聚丙烯酰胺凝膠檢測進行基因分型與條帶讀取［29］。

表1 不同品種群牡丹品種及其表型特征Table 1 Tree peony cultivars of different group and their phenotypic traits

表2 SSR引物信息Table 2 Information of SSR primers

1.4 數據處理

SSR引物擴增后清晰可辨可重復條帶記為“1”，同一位置缺失記為“0”，建立原始數據矩陣。采用Popgene 1.32計算每對引物擴增位點等位位點數、多態性信息量、獲得各物種間遺傳距離和相似性系數矩陣［32］。在遺傳相似系數基礎上，利用 NTSYS-pc（Ver 2.1）按非加權平均法（UPGMA）進行聚類分析［33］。

2 結果與分析

2.1 主要農藝性狀表現

試驗所選用的牡丹大部分為中晚花品種，其株型為直立開張，花型多為菊花型、薔薇型及單瓣型，花色差異稍大，分屬于紅、白、粉、黃、藍、紫、黑大色系（表1）。

2.2 SSR引物篩選及評價

采用MISA對高通量二代測序獲得的81 725個unigenes進行SSR發掘，共獲得8 663個SSR，使用隨機選取的22對引物，對30個來自不同品種群的牡丹供試樣品進行PCR擴增，所有引物均能擴增出清晰條帶并表現出多態性差異，共獲得90個等位基因，多態位點的等位基因數（N a）為2—6個，平均等位基因數為4.09個，其中P2位點等位基因數為6個。Shannon’s多樣性指數（I）范圍為0.1584—1.4000，平均為0.9731，Nei’s基因多樣度（H）范圍為0.0713—0.7469，平均為0.5250。表觀雜合度（Ho）、期望雜合度（He）變化范圍分別為0.1481—1.000（平均 0.528）、0.0727—0.7908（平均 0.5379）。22個多態位點 PIC（Polymorphic Information Content）值介于0.0713—0.7569，平均為0.5250，其中有16個高度多態位點（PIC＞0.5）、2個中度多態位點（0.25＜PIC＜0.5）、4個低度多態位點（PIC＜0.25）（表3）。

表3 22對SSR引物的多態檢測Table 3 Polymorphic detection of 22 pairs of SSR primers

2.3 牡丹不同品種群品種資源的遺傳相似系數分析

以遺傳距離矩陣為分析對象，根據SSR標記計算親本間遺傳相似系數，得到30個品種遺傳相似系數為0.1750—0.9643，平均值為0.4990。其中，‘粉蓮’和‘渡世白’遺傳相似系數最小，為0.1750，表明二者親緣關系最遠；其次為‘藍線女’和‘時雨云’，為0.1865。‘輕羅’和‘雀好’遺傳相似系數最大，為0.9643，表明二者親緣關系最近，其次為‘昌紅’和‘輕羅’，為0.9316（表4）。研究結果表明：不同牡丹品種群間的遺傳相似性較小，而同一品種群間遺傳相似系數較大，遺傳差異性不大。

表4 不同品種群部分牡丹品種遺傳距離和相似系數Table 4 Genetic distance and sim ilarity coefficient of several tree peony cultivars of different group

2.4 SSR位點對不同品種群牡丹品種的聚類分析

聚類分析結果表明：相似系數為0.68時可將30個牡丹品種聚成Cluster I和Cluster II兩大類。Cluster I又可分為Subcluster I和Subcluster II兩個亞類，Subcluster I的Group A1包括中原品種和國際品種，Group A2中除中原品種和國際品種外，還包含西北品種‘紅蓮’；Subcluster II的Group B1中包括國際品種和中原品種‘飛雪迎夏’，而Group B2僅包含西北品種（圖1）。Cluster II由西南品種和江南品種組成，可分為 Subcluster III和 Subcluster IV。隸屬西南品種群的‘天蓬牡丹’單獨聚為 Subcluster III；Subcluster IV的Group C1被分為Subgroup D1和Subgroup D2，其中Subgroup D1僅包含西南品種群的‘粉蓮’，Subgroup D2中，西南品種群的‘金腰梅’聚為一類，剩余6個隸屬江南品種群的牡丹品種‘輕羅’‘昌紅’‘雀好’‘呼紅’‘燕江紅’‘西施’聚為一類，Subcluster IV的Group C2中隸屬江南品種群的‘四旋’單獨聚為一類（圖1）。

圖1 不同品種群30個牡丹品種的SSR聚類分析Fig.1 Cluster analysis of 30 tree peony cultivars based on SSR markers

3 結論與討論

牡丹品種繁多且新品種不斷開發，導致其種質資源遺傳多樣性研究愈加困難。因此，牡丹種質資源遺傳多樣性研究至關重要。SSR具有簡便高效的特點，可通過同源比對獲得轉錄本差異，在遺傳多樣性分析、分子標記輔助選擇育種中具有較高的應用價值［34-36］。數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST）已公開的牡丹EST序列，為牡丹SSR標記的開發提供了豐富而寶貴的資源。本研究共獲得22對SSR多態性引物，豐富了牡丹SSR來源。李美琴等［37］報道SSR位點重復基元多為二、三堿基重復，說明在SSR開發過程中2—4個核苷酸重復基元的開發成功率相對較高，而本研究開發的SSR位點多為五堿基重復的SSR位點。

表觀等位基因數（N a）是衡量SSR位點多態性的重要指標，其大小與研究對象遺傳特性有關［38］。本研究中來自5個品種群的30個牡丹品種在22個SSR位點上的平均表觀等位基因數為4.09，高于多態性引物在牡丹品種間的等位基因位點數目［24-25，31］。Wu等［23］對牡丹的多態性評估表明，N a變化范圍為3—12，平均為7.4。Shannon’s多樣性指數（I）是評價遺傳多樣性的重要指標。本研究中，來自5個品種群的30個牡丹品種在22個SSR位點上的Shannon’s多樣性指數（I）為0.9731。上述多項指標表明，本研究中5個品種群的30個牡丹品種遺傳多樣性水平較高。

PIC值是衡量群體變異程度的重要參數，是基于所檢測到的等位基因數目及分布頻率，其大小取決于所用引物數目和被擴增基因型的數目，在一定意義上是檢測引物多態性能力的度量。引物PIC值越高，它所揭示的等位基因變異能力就越強［34］。本研究中22個SSR多態位點的PIC值介于0.0713—0.7469，平均值為0.5250，說明本研究所用的SSR引物在其變異豐富的測試品種中多態性較高。

利用已開發的SSR引物鑒定牡丹種質資源遺傳關系，發現西北品種群‘紫斑’牡丹與西南品種群的四川牡丹緊密相關［23，39］。研究發現，‘紫斑’牡丹是西北品種群的祖先［25，29］。‘二喬’‘姚黃’‘豆綠’‘琉璃冠珠’等國際品種與中原品種群聚在一起，說明國際品種起源于中國的中原牡丹品種群［24-25，40］。牡丹野生種是否均參與栽培牡丹的起源觀點尚不統一［41］。本研究發現，相似系數較高的栽培品種聚在一起，說明其親緣關系較近。

蔡長福［42］利用19對SSR引物對牡丹3個雜交組合進行遺傳多態性分析，發現‘鳳丹白’ב紅喬’雜交組合親本間DNA水平的多態性最高，19對SSR引物共檢測到27個多態性位點，親本間遺傳距離為0.7070，說明這些SSR引物可以用于雜交后代的早期鑒定。本研究開發的SSR來自于不同中原牡丹品種轉錄組測序結果，22對SSR引物在不同牡丹品種群牡丹的自然群體中具有多態性，本研究可為牡丹SSR標記的開發與鑒定補充資源。

牡丹具有重要的觀賞、藥用和食用價值，其核心種質特性了解較少，重要性狀定位等遺傳研究薄弱，現有栽培品種的分離純化，可為優良品種選育提供基因資源。本研究共開發22對SSR標記，其基因組檢測結果表現為條帶清晰可辨，表明這些SSR標記具有多態性，22對SSR標記能有效鑒定牡丹種質資源的遺傳多樣性，研究結果可為探究牡丹遺傳多樣性和牡丹資源保存提供理論依據。

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