小麥小孢子培養愈傷組織的高頻誘導及其綠苗再生

何 婷,郭桂梅,陳志偉,張述偉,宗營杰,陸瑞菊,王亦菲,劉成洪

（上海市農業科學院生物技術研究所，上海市農業遺傳育種重點實驗室，上海 201106）

小麥（Triticum aestivum L.）是在世界各地廣泛種植的禾本科植物，是最重要的糧食作物之一，在中國是僅次于水稻的第二大作物。在小麥育種中，加倍單倍體只用一個世代就可以得到純合的二倍體植株。一直以來，花藥培養是小麥獲得單倍體的主要手段，游離小孢子培養是從花藥培養發展而來的，在單細胞水平上獲得純系的培養方法，可以獲得大規模單倍體（Haploid）和加倍單倍體（Doubled Haploid，DH）群體。小孢子離體培養技術為研究小孢子從配子體發育轉向孢子體發育的影響因子及其調控機理提供了理想的實驗系統；該技術與分子技術相結合可以提高目標基因的重組效率，并可為研究小孢子全能性表達的分子機制試驗供試材料。小麥游離小孢子培養自1993年由Tuvesson等［1］進行報道后，近幾年來又取得了一定的進展［2-6］，但在預處理、誘導及分化等技術環節上有待于進一步研究。幾乎所有麥類作物小孢子培養實驗體系都采用脅迫處理誘導雄核發育，在離體條件下對幼穗、花藥或小孢子進行物理、化學等預處理方法來啟動或加強小孢子胚胎的發生過程。本試驗所用材料是由墨西哥國際玉米小麥改良中心選育的小麥品種‘Alondra’，其具有農藝性狀良好、株型緊湊、莖稈粗壯不易倒伏、結實多且籽粒飽滿以及對銹病和白粉病有較好的抗性等優點，但重感赤霉病［7］。試驗以‘Alondra’離體穗為外植體，探討不同預處理方法對小孢子愈傷誘導過程的影響，闡明不同預處理方法對愈傷組織形成的促進或抑制作用，并建立高效穩定的愈傷誘導技術。該技術將為進一步使用小孢子培養與雜交、誘變、脅迫篩選等方法相結合對小麥進行利用和改良提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以2017年8月上海市農業科學院人工氣候室內種植的小麥品種‘Alondra’為試驗材料，選取中部小花小孢子處于單核中-晚期的離體穗為外植體。

1.2 小孢子的游離與培養

將離體穗去除多余葉片，包裹保鮮袋放置于5℃暗培養箱內，冷藏10 d后接取花藥，接種時，穗子用質量分數為10%消毒靈溶液浸泡10 min，無菌水沖洗3—4次，完全去除消毒液。每50 mL離心管接入1 000枚花藥，加入12 mL提取液，勻漿機旋切至花藥壁完全破碎，使小孢子完全釋放出來；用300目篩網過濾至13 mL離心管中，濾液以400 r/min離心5 min，此時小孢子沉淀至離心管底部，吸出上清液，加入3 mL提取液吹打混勻，轉入培養皿（60 mm×35 mm）中，封口膜封口，置于培養箱中暗處理2 d。將小孢子懸浮液轉入13 mL離心管中，以600 r/min離心5 min，使小孢子沉淀于管底，吸出上清液。培養前將小孢子先用質量分數為21%麥芽糖溶液純化，收集活的小孢子，然后用誘導培養基將小孢子密度調節至1.0×105個/mL，取1 mL小孢子懸浮液接種于培養皿（35 mm×15 mm）中，封口膜封口，26℃暗培養30 d。

1.3 小孢子的預處理方法

設置5組預處理試驗：1）冷藏離體穗噴灑提取液和不噴灑提取液試驗；2）游離小孢子33℃熱激暗處理與26℃暗處理試驗；3）提取液中添加6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）和不添加6-BA試驗；4）小花5℃、3 d冷藏后游離小孢子與直接游離小孢子試驗；5）小孢子培養20 d后更換新鮮誘導培養基與不更換培養基試驗。且每組試驗4個重復。

1.4 提取液與誘導培養基

提取液為60 g/L甘露醇，添加1.1 g/L CaCl2和0.976 g/LMES（N-嗎啡乙烷磺酸），pH調節至5.8，并用于離體穗的噴灑；誘導培養基以改良的N6培養基為基本培養基，添加麥芽糖90 g/L，2，4-D 2.0 mg/L和KT 0.5 mg/L，pH調節至5.8。提取液與誘導培養基均過濾滅菌。

1.5 數據分析

愈傷組織產量：小孢子誘導培養30 d后，吸取液體培養基后用電子天平稱量愈傷質量，用mg/皿表示，4個重復數據采用LSD法統計分析。

2 結果與分析

2.1 離體穗噴灑提取液對小孢子愈傷組織產量的影響

圖1可見，在取材后離體穗冷藏期間不噴提取液與噴灑提取液處理，愈傷組織產量分別為25.8mg/皿和23.3 mg/皿，無顯著差異。因此，在離體穗階段噴灑提取液不能提高愈傷組織產量，說明離體穗在葉片包裹下噴灑的提取液未對小孢子的分裂和胚狀體愈傷的發育產生促進作用。

圖1 不噴灑提取液的愈傷（左）和噴灑提取液的愈傷（右）Fig.1 Calli sprayed without extracting solution（left）and calli sprayed with extracting solution（right）

2.2 熱激預處理對小孢子愈傷組織產量的影響

在游離小孢子預處理2 d時，33℃暗處理的小孢子膨脹速度大于26℃暗處理的小孢子，且經33℃熱激的小孢子在培養過程中更易于觀察到星狀結構，該結構被認為與胚狀體愈傷的出現存在相關性。由圖2可見，33℃預處理的小孢子經30 d誘導培養基培養后，愈傷組織產量均值為48.2 mg/皿，顯著高于26℃預處理條件下獲得的愈傷組織產量30.6 mg/皿，說明33℃高溫對小麥小孢子胚狀體愈傷的獲得有很好的促進作用。這與高增玉等［8］高溫預處理不同小麥外植體的結果相似。

2.3 提取液中添加6-BA對小孢子愈傷組織產量的影響

由圖3可見，在提取液中添加20 mg/L 6-BA并沒有增加愈傷組織產量，相反使愈傷組織產量下降（圖4B），與對照組（圖4A）存在明顯差異，與高增玉等［9］在幼穗階段經BA預處理后大大增加了胚狀體產量的結果不一致。本研究表明，6-BA對小孢子的有絲分裂沒有促進作用，更適合作為分化階段的主要激素。

圖2 不同預處理溫度的小麥小孢子愈傷Fig.2 M icrospore calli under different tem perature pretreatments

圖3 含6-BA提取液游離小孢子的愈傷產量Fig.3 M icrospore callus yield of isolated m icrospores with 6-BA extracting solution

圖4 不同預處理條件下小麥小孢子愈傷Fig.4 W heatm icrospore calli under different pretreatments

2.4 小花低溫預處理對小孢子愈傷組織產量的影響

將小花接入離心管后經過3 d、5℃低溫預處理再進行小孢子游離，并在33℃暗培箱中高溫預處理2 d，30 d后獲得的愈傷產量均值為129.4 mg/皿（圖4C），與沒有低溫預處理小花直接游離小孢子的對照組48.2 mg/皿（圖4A）存在顯著差異。由此可見，小花低溫預處理與游離小孢子高溫預處理相結合獲得最多胚狀體愈傷組織，與王春霞等［10］對花藥進行低溫預處理后對胚狀體的發育有促進作用結論一致。

2.5 更換誘導培養基對小孢子愈傷組織產量的影響

在誘導培養基中培養至20 d時，吸出原有液體培養基重新加入1 mL新鮮培養基，培養至30 d時與對照比較愈傷組織重量。愈傷組織產量為90.3 mg/皿（圖4D）顯著高于對照組（圖4A），說明新鮮培養基對愈傷的生長產生了新的刺激作用，加速了胚狀體生長速度，單個愈傷明顯大于對照組單個愈傷。

2.6 小麥小孢子離體培養的愈傷組織誘導及綠苗分化

在自然條件下，單核靠邊期的小麥小孢子先進行一次不均等有絲分裂，形成一個營養核和一個生殖核，接著生殖核再發生一次有絲分裂，形成了3-細胞的成熟花粉。在離體條件下，通過預處理方法阻斷小孢子的兩次有絲分裂，促使小孢子從配子體發育向孢子體發育轉化，從而使細胞核快速移動至小孢子中心，由小液泡環繞形成星狀結構；在星狀體形成后，該結構是否可由細胞核的對稱分裂轉變為多細胞結構是小孢子離體發育過程的關鍵，但在光學顯微鏡中無法精確觀察到這一過程的始發時刻。沒有發生星狀結構或星狀體無法進一步形成多細胞結構的小孢子在發生質壁分離后萎縮或停止在前期的多核狀態，只有完成從星狀體到多細胞結構演化的小孢子才有潛力最終形成胚狀體愈傷。圖5為小麥小孢子愈傷誘導、綠苗分化及再生植株壯苗生根的過程。本試驗通過一系列預處理方法篩選和協同作用，最終獲得了穩定的愈傷產量，在分化培養基中愈傷開始分化形成小麥小孢子綠色再生植株。

圖5 小麥小孢子培養誘導及分化和生根Fig.5 W heatm icrospore callus induction，green plantlet differentiation and radication

3 結論與討論

麥類作物小孢子培養中小麥小孢子培養技術的發展尤為緩慢，本試驗團隊借助領先的大麥、青稞小孢子培養技術［11-13］和較純熟的水稻小孢子培養技術［14-15］，對小麥小孢子培養過程中胚性愈傷組織的誘導進行了多種預處理試驗，確定了小麥小孢子培養的最佳預處理方法為接種小花5℃低溫處理3 d，游離小孢子33℃熱激處理2 d，經過純化轉入誘導培養基，26℃暗培養30 d。該方法在小麥品種‘Alondra’上獲得了穩定的愈傷產量，為進一步在其他基因型上進行拓展打下了堅實基礎。

此外，胚性愈傷組織是遺傳轉化的優良受體，小孢子胚性愈傷較成熟胚、幼胚、原生質體等誘導的愈傷具有胚狀體群體數量巨大，性狀穩定、一致，再生頻率高等獨特的優勢［16-18］。農桿菌介導侵染植物外植體是獲得轉基因植株的常用方法，而用攜帶目標基因的農桿菌菌液直接侵染小孢子愈傷，在侵染成功后隨著愈傷組織分化而形成再生植株，是不同于以往基于植株、成熟胚、幼胚等為外植體獲得轉基因植株的新方法。與大麥小孢子離體培養條件下大麥小孢子再生植株的自然加倍頻率較高不同的是，小麥小孢子再生植株的自然加倍率偏低，這為獲得單倍體轉基因植株提供了有利條件，也為小麥基因編輯技術提供了一種新穎的方法。

［1］TUVESSON IK D，OHLUND R C V.Plant regeneration through culture of isolated microspores of Triticum aestivum L.［J］.Plant Cell，Tissue Organ Culture，1993，34（2）：163-167.

［2］李光威，蘭素缺，孫寶啟.小麥游離小孢子培養的研究［J］.華北農學報，2001，16（1）：83-87.

［3］王宏芝，楊成民，魏建華，等.低溫預處理和高溫饑餓脅迫對冬小麥小孢子胚胎發生和植株再生的影響［J］.農業生物技術學報，2004，12（4）：390-395.

［4］秦余香，夏光明.小麥的小孢子培養［J］.植物學通報，2004，21（5）：625-630.

［5］董靜，鄔飛波，張國平.麥類作物小孢子培養研究進展［J］.麥類作物學報，2005，25（2）：102-106.

［6］呂樹作，李雪紅，王潔瓊，等.小麥小孢子胚胎發生機制及培養技術研究進展［J］.河南農業科學，2016，45（9）：8-14.

［7］李明浩，陳煒，邢莉萍，等.普通小麥品種 Alondra’s遺傳轉化體系的建立［J］.植物學報，2010，45（4）：466-471.

［8］高增玉，趙愛菊，陳希勇，等.預處理形式對小麥小孢子胚胎發生的影響［J］.河北農業科學，2009，13（4）：41-42.

［9］高增玉，趙愛菊，劉玉萍，等.利用6-BA促進小麥小孢子胚胎發生的研究［J］.河北農業科學，2008，12（5）：66-68.

［10］王春霞，廖玉才，張杰，等.低溫和誘導時間對小麥小孢子培養的影響［J］.華中農業大學學報，2007，26（2）：167-170.

［11］陸瑞菊，徐紅衛，陳志偉，等.源于小孢子培養的大麥耐鹽變異體獲取［J］.植物生理學報，2012，48（11）：1069-1078.

［12］陸瑞菊，陳志偉，何婷，等.化學誘變劑和60Co處理對大麥小孢子低氮脅迫培養的影響［J］.植物生理學報，2013，49（12）：1442-1446.

［13］陸瑞菊，高潤紅，郭桂梅，等.青稞的小孢子離體培養和植株再生［J］.植物生理學報，2014，50（12）：1764-1768.

［14］郭桂梅，高潤紅，卜姝明，等.預處理對水稻小孢子誘導愈傷組織產量和綠苗分化的影響［J］.上海農業學報，2014，30（5）：51-55.

［15］劉成洪，何婷，郭桂梅，等.粳稻 F1小孢子培養條件的優化［J］.植物生理學報，2017，53（9）：1813-1818.

［16］李明浩，陳煒，邢莉萍，等.農桿菌介導小麥遺傳轉化條件的優化［J］.分子植物育種，2010，8（2）：388-392.

［17］宋成麗，王翾，徐虹，等.農桿菌介導的小麥成熟胚轉化的影響因素［J］.麥類作物學報，2012，32（2）：209-214.

［18］劉鑫，魏學寧，張學文，等.小麥原生質體高效轉化體系的建立［J］.植物遺傳資源學報，2017，18（1）：117-124.