淹澇處理下櫻桃總RNA提取方法的建立與優(yōu)化

生利霞,孟祥毅,王 猛,王 倩,馮立國

（揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009）

櫻桃（Prunus serrulata）為薔薇科櫻屬落葉果樹，味美形嬌，營養(yǎng)豐富，在我國有著悠久的種植歷史。櫻桃品種繁多，從熱帶到溫帶都有種植，堪稱世界上栽培分布最廣的水果之一。果實(shí)不僅可鮮食，還是食品、藥品工業(yè)的重要原料。但櫻桃植株根系淺，對環(huán)境變化反應(yīng)敏感。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的興起和發(fā)展，櫻桃抗?jié)场帷Ⅺ}等重要抗脅迫的基因工程改良已經(jīng)開展［1］，而制備大量質(zhì)量好、純度高的RNA是基因克隆、表達(dá)及轉(zhuǎn)基因研究的前提和重要環(huán)節(jié)。

櫻桃葉片與根莖組織富含多糖、多酚及色素等次生代謝物質(zhì)，總RNA提取受這些成分的干擾較重，尤其進(jìn)行逆境脅迫處理時，葉片中葉綠素破裂、酶開始降解，根系不斷褐化等一系列問題都會嚴(yán)重影響RNA的提取質(zhì)量［2-3］。目前，雖然各種RNA提取方法被廣泛報(bào)道，但由于在不同的狀態(tài)下不同植物及相同植物的不同組織存在很大差異，因此篩選一種適用于淹澇處理后櫻桃總RNA提取方法至關(guān)重要。本試驗(yàn)以淹澇處理后的‘沂蒙山櫻’材料，采用不同方法提取其總RNA，結(jié)合質(zhì)量檢測及RT-PCR驗(yàn)證，建立適合淹澇處理后櫻桃葉片與根系RNA的提取方法，旨在為今后櫻桃抗?jié)撤肿由飳W(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 櫻桃淹澇處理

以‘沂蒙山櫻’為試材，進(jìn)行淹水處理。采用盆栽淹水法。挑選苗齡、大小、長勢一致的扦插苗，定植于同規(guī)格塑料盆中，土壤類型一致（園土∶蛭石=2∶1），每盆1株，總共30盆。8個月后選取大小、長勢一致的植株進(jìn)行淹水處理。試驗(yàn)在長∶寬∶深=4.5∶1.5∶0.7（m）水槽中進(jìn)行，連續(xù)淹澇處理4 d，保持水層高于盆土表面2—3 cm，定時補(bǔ)水以保證水位。

1.1.2 試材取樣

在澇脅迫處理第0、1、2、3、4天取樣（S0、S1、S2、S3、S4），隨機(jī)選取 3株，分別取其幼嫩根系和葉片組織，迅速置于液氮中速凍，帶回實(shí)驗(yàn)室-80℃保存。選擇未淹澇處理（S0）和淹澇4 d（S4）的櫻桃根系和葉片進(jìn)行RNA提取方法比較，其余樣品用于RT-PCR檢測。

1.2 方法

1.2.1 植物總RNA提取試劑盒法

具體操作按照TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit（Cat#9769）總RNA提取試劑盒附帶的使用說明進(jìn)行。

1.2.2 植物CTAB法

CTAB法具體操作按照參照馮立國等［3］方法。

1.2.3 改良植物總RNA提取試劑盒法

在TaKaRa RNA提取試劑盒法的基礎(chǔ)上，針對櫻桃組織的特點(diǎn)進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的具體步驟如下：

（1）超低溫保存的試材轉(zhuǎn)移至液氮預(yù)冷的研缽中研磨，期間不斷加入液氮，直至研磨成粉狀。稱取300 mg粉狀葉片于1.5 mL去酶離心管中（根系稱取400 mg于2.0 mL去酶離心管中）。

（2）加10μL的β-巰基乙醇和1 000μL PE的混合液反復(fù)搖晃離心管直至充分混勻（約30 min），離心（4℃，12 000 r/min，5 min）。

（3）將上清液小心吸取到新的2.0 mL去酶離心管中。加上清液1/10體積的Buffer NB，劇烈搖勻（此時會出現(xiàn)沉淀），離心（4℃，12 000 r/min，5 min）。

（4）將上清液小心吸取于新的2.0 mL去酶離心管中，加等量氯仿∶異戊醇（24∶1），輕輕混勻，離心（4℃，12 000 r/min，10 min）。

（5）將上清液小心吸取于新的2.0 mL去酶離心管中。加入500μL的Buffer RL（使用前加入10μL 50×DTT Solution），使用移液槍吹打混勻。

（6）加1/2體積的無水乙醇（可能會有沉淀出現(xiàn)），用移液槍吹打混勻。

（7）立即吸取600μL混合液于RNA Spin Column中。（如果混合液的體積大于600μL，分批加入，每次加入的體積不大于600μL），離心（4℃，12 000 r/min，1 min），棄濾液。將 RNA Spin Column放回于2 mL Collection Tuble中。

（8）吸取500μL的 Buffer RWA加入至RNA Spin Column中，離心（4℃，12 000 r/min，30 s），棄濾液。

（9）吸取 600μL的 Buffer RWB沿管壁加入至 RNA Spin Column中，離心（4℃，12 000 r/min，30 s），棄濾液。

（10）DNase I消化（可選擇）：利用本試劑盒提取的RNA時可以有效去除植物中絕大部分基因組的DNA，提起RNA一般不含基因組DNA。如后續(xù)試驗(yàn)對RNA的純度要求嚴(yán)格，可以選擇在RNA Spin Column膜上進(jìn)行DNase I消化。

（11）DNase I反應(yīng)液的配制：取 4μL Recombinant DNase I（RNase free，5 U/μL），5μL 10×DNase I Buffer，41μL RNase Free dH2O于新的1.5 mL RNase Free Tuble中，使用移液槍混合均勻。

（12）加入50μL DNase I反應(yīng)液于RNA Spin Column膜中央，室溫靜置15 min（溫度不可過高）。

（13）加入 350μL的 Buffer RWB于 RNA Spin Column膜中央，離心（4℃，12 000 r/min，30 s），棄濾液。

（14）重復(fù)步驟9。

（15）將RNA Spin Column重新安置于2 mL Collection Tuble上，12 000 r/min離心2 min。

（16）將RNA Spin Column安置于1.5 mL的 RNase Free Collection Tuble（試劑盒提供）上，在 RNA Spin Column膜中央加入10—30μL的RNase Free dH2O室溫靜置5 min（以樣品質(zhì)量可適度調(diào)整），離心（4℃，12 000 r/min，2 min）洗脫 RNA。

（17）若想提高RNA的收量，可重復(fù)將洗脫液再加入于RNA Spin Column的膜中央，室溫靜置5 min，離心（4℃，12 000 r/min，2 min）洗脫 RNA。

1.2.4 RNA質(zhì)量和濃度檢測

取2μL RNA樣品加2μL 10×loading Buffer，2μL RNase-free水，點(diǎn)樣于1%瓊脂糖凝膠上，220 V恒壓電泳10 min，在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察RNA條帶，并拍照記錄。取1μL RNA樣品用DEPC水稀釋50倍，混勻，核酸蛋白檢測儀（BioPhotometer plus，Eppendorf公司，德國）測定 RNA的濃度，記錄濃度、OD260/OD280與OD260/OD230數(shù)值用于純度分析，3—4次重復(fù)，計(jì)算平均值。

1.2.5 RT-PCR

采用PrimeScript RT reagent KitWith gDNA Eraser（寶生物公司，大連）合成cDNA第一鏈，PCR檢測采用20μL反應(yīng)體系，Actin引物（JN399225）（ActinF：5’-ACTCCTCCCACATTGCTGTTA-3’；ActinR：5’-CTTCAAGAACTTGGGCTCCTT-3’）。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，Marker均為DL 2000。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取的總RNA完整性檢查

以未淹澇處理（S0）和淹澇處理4 d（S4）的‘沂蒙山櫻’葉片和根系為試材，分別采用TaKaRa RNA提取試劑盒法、改良TaKaRa RNA提取試劑盒法和CTAB法提取其總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1，圖2）。結(jié)果表明，采用改良TaKaRa RNA提取試劑盒法提取櫻桃葉片與根系總RNA的28S rRNA、18S rRNA條帶清晰，明亮，且28S rRNA的亮度明顯高于18S rRNA，說明該方法提取的總RNA完整性高，可用于后續(xù)檢驗(yàn)；采用TaKaRa RNA提取試劑盒法和CTAB法提取的櫻桃葉片總RNA，28S rRNA、18S rRNA條帶模糊比較暗，拖尾嚴(yán)重，條帶完整性較差，根系總RNA的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)一條模糊條帶，說明總RNA嚴(yán)重降解，完整性很差，不符合分子生物學(xué)試驗(yàn)要求，說明改良TaKaRa RNA提取試劑盒法可以很好地解決因淹澇脅迫對RNA完整性的影響。

圖1 不同方法提取的櫻桃葉片總RNA的電泳檢測Fig.1 Electrophoretic pattern of total RNA extracted from leaves of cherry using differentmethods

圖2 不同方法提取的櫻桃根系總RNA的電泳檢測Fig.2 Electrophoretic pattern of total RNA extracted from roots of cherry using differentmethods

2.2 不同方法提取的總RNA純度與濃度檢測

純度較好的RNA其OD260/OD280值應(yīng)介于1.8—2.0，OD260/OD230值應(yīng)大于2.0。若OD260/OD280值小于1.8，則表明多糖、蛋白和酚類物質(zhì)較多，若OD260/OD280值大于2.0，則表明RNA有部分降解。OD260/OD230小于2.0，則表明裂解液中有β-巰基乙醇和酚類物質(zhì)殘留［5］。由表1、2可見，采用改良TaKaRa RNA提取試劑盒法提取的櫻桃葉片與根系的OD260/OD280值介于1.95—1.99，OD260/OD230值介于2.03—2.13，RNA質(zhì)量濃度均較高，說明所提取的RNA純度較好，降解較少，蛋白等雜質(zhì)的污染較少。而另外兩種方法均不符合RNA純度要求，說明RNA存在降解，雜質(zhì)較多，質(zhì)量較差。

表1 不同方法提取的櫻桃葉片總RNA濃度和純度檢測Table 1 Concentration and purity of RNA from leaves of cherry using differentmethods

表2 不同方法提取的櫻桃根系總RNA濃度和純度檢測Table 2 Concentration and purity of RNA from roots of cherry using differentmethods

2.3 RT-PCR檢測

采用改良TaKaRa RNA提取試劑盒法分別提取淹澇處理4 d過程中（S0、S1、S2、S3、S4）‘沂蒙山櫻’的根系RNA，并以其為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將合成的cDNA用櫻桃Actin引物（JN 399225）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。RT-PCR的結(jié)果如圖3所示，葉片與根系均擴(kuò)增出約100 bp的cDNA的片段。擴(kuò)增條帶均清晰明亮，能夠滿足后續(xù)分子生物試驗(yàn)對RNA質(zhì)量的要求。

圖3 淹澇處理后櫻桃葉片和根系總RNA的RT-PCR檢測Fig.3 RT-PCR result of total RNA from leaves and roots of cherry after waterlogging treatment

3 討論

櫻桃本身含有較多的多糖、多酚、蛋白質(zhì)及次生代謝物等［8］，RNA提取過程中需要去除，同時還要防止逆境脅迫等次生災(zāi)害所引起的RNA降解。因此，在淹澇脅迫后依然可以獲得純度高、完整性好的總RNA尤為重要。傳統(tǒng)CTAB法具有明顯的局限性，其樣品的需求量大，操作繁瑣，用時間久，對于數(shù)目多且稀少的樣品并不適合［7］。淹澇處理中，櫻桃根系長時間浸泡在水中，導(dǎo)致根系褐化、蛋白質(zhì)失活、酶降解，甚至腐爛［2］，大大增加了RNA提取的難度，因此，采用CTAB法提取淹澇處理后櫻桃根系的RNA，其質(zhì)量并不理想。

TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit是針對植物 RNA提取試劑盒，具有操作簡單、用時短，RNA質(zhì)量良好等特點(diǎn)，廣泛適用于各種植物材料RNA的提取，效果良好。本試驗(yàn)中，采用TaKaRa RNA提取試劑盒法提取櫻桃總RNA遇到了一些問題，主要表現(xiàn)為葉片和根系在裂解過程中褐化嚴(yán)重，在過濾膜上有褐色雜質(zhì)，并導(dǎo)致所得RNA具有顏色。這可能是因?yàn)闄烟胰~片和根系中多糖和酚類物質(zhì)較多，在樣品裂解過程中葉片酚類物質(zhì)極容易被氧化成醌類等次生代謝物質(zhì)，并與蛋白質(zhì)及RNA結(jié)合，使葉片褐化，影響RNA的分離純化［9］，至于該褐色雜質(zhì)具體為何化合物，將在后續(xù)研究中通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行定性定量分析。

本試驗(yàn)在TaKaRa RNA提取試劑盒法的基礎(chǔ)上，針對櫻桃葉片和根系提取過程中遇到的問題進(jìn)行了優(yōu)化。在PE裂解液中加入1/100的β-巰基乙醇，從而有效地解決了褐化問題，這可能是由于β-巰基乙醇為強(qiáng)還原劑，能夠抑制細(xì)胞色素酶和多酚氧化酶的活性［10］，對櫻桃葉片與根系的酚類物質(zhì)去除效果較好。加之氯仿與異戊醇可以與殘留的酚類物質(zhì)反應(yīng)，并去除蛋白質(zhì)，因此可以看出在上清液與氯仿/異戊醇混合液中有一層明顯的雜質(zhì)［11-12］。通過對試劑盒法改良，可逐步解決酚類物質(zhì)和蛋白質(zhì)的干擾問題，最終得到較高純度的RNA。

綜上所述，本試驗(yàn)建立的改良RNA提取試劑盒法可在淹澇處理下依然可以獲得具有較高完整性和純度的高質(zhì)量RNA，是理想的櫻桃組織RNA的提取方法，適用于大批量樣品的分子生物學(xué)試驗(yàn)研究。

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