脫落酸在低氮條件下延緩擬南芥葉片衰老

尹冬梅,梁 可,高馬也,李 昊,倪迪安

（上海應用技術大學生態學院，上海 201418）

植物葉片衰老是葉片發育的最終階段，不僅受到內部基因的表達調控，同時受到植物生長外部因素的影響。衰老引起的葉片同化功能的減退極大地限制了農作物產量的增加，對蔬菜等作物也會造成采摘后損失。因此，研究葉片衰老，不僅有助于認識發育過程，而且能夠利用研究結果來建立調控葉片衰老的方法。

衰老是一個高度組織和管理完善的過程［1］。其中葉片衰老最重要的功能包括老葉氮的再轉移。葉片衰老可以通過缺氮被加速，特別是當光合碳供給高的時候［2］。在無機氮同化合成含氮化合物中需要能源供應和碳骨架，所合成的氮化合物將用于產生貯存蛋白［3］。貯藏蛋白衰老過程中催化進一步產生了含氮化合物隨后運輸到活躍的生長區域。因此，含氮代謝和碳代謝在衰老過程中起到關鍵作用。此外，外部（氮可用性和光）和內部（調節代謝物和C/N比）因素及信號也顯示了葉片對衰老感應［4］。低氮含量環境下生長的植物衰老的跡象出現較早，而且缺氮環境更是誘發及加速衰老的誘導因素［5］。

植物激素如脫落酸（ABA）調節葉片衰老過程［6］。在添加葡萄糖的低氮培養基上生長的ABA缺陷型突變體的衰老顯著加速［7］。ABA被認為是促進葉片衰老的植物激素之一［8］。本研究在培養中添加不同糖源和氮含量，測定Fv/Fm值、葉綠素含量和衰老相關基因AtSAG12［9］的相對表達量，研究在低氮環境下外源ABA對擬南芥葉片衰老的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗采用擬南芥哥倫比亞生態型野生型（Col-0）和ABA敏感突變體（ahg3）［10］為材料，用質量分數0.1%的氯化汞表面消毒，接種于含有MS鹽和瓊脂的生長培養基上，于4℃黑暗條件下放置2 d，以獲得種子萌發和生長的一致性，并在25℃、16 h光照、光照強度約2 500 lx條件下培養7 d后，轉移到含有不同碳源、氮含量（表1）和ABA濃度的MS培養基上培養35 d。ABA（生工生物）通過0.22μm濾膜過濾滅菌后加入到含有不同的糖源和含氮量的高壓滅菌MS培養基中。

表1 培養基成分Table 1 Composition ofmedia

1.2 方法

1.2.1 PSII原初光能轉化效率(Fv/Fm)的測定

PSII原初光能轉化效率（Fv/Fm）可反映植物葉片的衰老情況［11］，使用便攜式調制葉綠素熒光儀PAM-2500（Walz，Effeltrich，Germany），取擬南芥葉片各5片，遮光情況下用葉片夾夾上，暗適應20 min，點擊窗口的Fv/Fm按鈕，2 s后讀取Fv/Fm數值。

1.2.2 植物葉片葉綠素含量的測定

根據常用的方法稍作改良［12-14］，準確稱取剪碎的新鮮樣品0.5 g，放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及2—3 mL質量分數為95%的乙醇，研磨成勻漿，再加乙醇10 mL，繼續研磨至組織變白。靜置3—5 min。全部過濾到25 mL棕色容量瓶中，用95%乙醇定容。把葉綠體色素提取液3 mL左右倒入光徑1 cm的比色杯內，以95%乙醇為空白對照，用752型分光光度計測定在663 nm和645 nm處的光密度值。根據Amon公式計算葉綠素含量。3次重復，計算每個處理的平均值。

式中：D663為在波長663 nm處的光密度值；D645為在波長645 nm處的光密度值；V為浸提液的最終體積（L）；W為葉片鮮重（g）。

1.2.3 AtSAG12的表達量測定

采用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒（TaKaRa）提取RNA，RNA經過DNA酶消化后用PrimeScriptTMRT Master Mix試 劑 盒 （TaKaRa，RR036A）反轉錄得到cDNA，使用SYBR Green I嵌合熒光法進行實時定量PCR試驗［15］，選用衰老相關基因AtSAG12為目標基因，以actin為內參，引物序列見表2。試驗使用ABIStepOne Plus Real Time PCR儀進行反應。

表2 用于定量PCR的引物序列Table 2 Sequences of primers used for quantitative PCR

2 結果與分析

2.1 低氮條件下蔗糖促進擬南芥葉片衰老

葉片的衰老情況可以通過PSII原初光能轉化效率（Fv/Fm）的測定來衡量［7］。Pourtau等［7］通過Fv/Fm的測定發現生長在添加葡萄糖的LN培養基上的擬南芥比在不添加任何碳源的LN培養基上生長的擬南芥衰老快得多。蔗糖是在大多數植物組織培養中常用的一種碳源。為進一步研究低氮環境對于擬南芥葉片衰老的影響，將野生型擬南芥（Col）和ABA敏感擬南芥突變體（ahg3）培養在不同含氮量（HN，LN）及碳源（111 mmol/L蔗糖或葡萄糖）的培養基中，經過35 d的生長后用葉綠素熒光儀檢測不同培養基上生長的擬南芥葉片的Fv/Fm值。結果顯示：生長在添加蔗糖的LN培養基上的Col和ahg3葉片比其他培養基中生長的葉片Fv/Fm低，且差異顯著（圖1），表明低氮條件下添加蔗糖可促進擬南芥葉片衰老。

圖1 低氮培養基中添加蔗糖促進擬南芥葉片衰老Fig.1 Adding sucrose to low-nitrogen medium accelerated A.thaliana leaf senescence

2.2 外源ABA在添加蔗糖的低氮環境下延緩了擬南芥葉片的衰老

ABA的添加以及氮濃度的高低對于擬南芥葉片衰老有決定性的影響。利用擬南芥ABA缺失突變體（aba1-1）的研究表明，內源ABA的降低（ABA合成減少的功能缺失突變體）加快了在添加葡萄糖的LN培養基上生長的擬南芥的衰老過程［7］。添加外源ABA促進植物葉片衰老有很多報道，例如外源ABA促進水稻［8］和擬南芥［13］的衰老。因此，在低氮環境下研究外源ABA（20 mmol/L）對葉片衰老的影響非常有意義。本試驗發現，在添加111 mmol/L蔗糖的低氮條件下，未添加ABA能夠明顯觀察到黃化現象，添加外源ABA后黃化現象并不明顯（圖2）。初步說明了在添加蔗糖的低氮環境下，ABA延緩了擬南芥的衰老進程。

圖2 外源ABA在添加蔗糖的低氮條件下延緩擬南芥葉片衰老Fig.2 Exogenous ABA delayed leaf senescence of ABA-sensitivemutant ahg3 cultured on low-nitrogen medium added with sucrose

為了進一步探索ABA在不同含氮含糖基礎條件下對擬南芥葉片衰老的影響，試驗中將野生型（Col）擬南芥分別種在含有不同質量濃度外源ABA（0 mg/L、10 mg/L、20 mg/L）、含氮量（HN，LN）和碳源（111 mmol/L蔗糖或葡萄糖）培養基中，培養35 d后測定Fv/Fm值。結果顯示：只有生長在含有蔗糖的低氮培養基中的Col植株葉片Fv/Fm值會隨著外源ABA濃度的增加而增加，而生長在其他培養基中的植株沒有觀察到這種現象（圖3-A）。

為了避免由于ABA的濃度過高對試驗結果產生影響，將ABA敏感型擬南芥（ahg3）作為試驗材料在添加較低質量濃度的ABA（0 mg/L、2 mg/L、5 mg/L）的上述培養基上生長，然后測定Fv/Fm值進行分析。得到了與野生型擬南芥（Col）相同的結果：只有生長在含有蔗糖的低氮培養基的ahg3植株葉片的Fv/Fm值會隨著外源ABA濃度的增加而增加，而生長在其他培養基中的植株葉片的Fv/Fm值會隨著外源ABA濃度的增加而降低（圖3-B）。上述結果進一步表明：ABA能夠延緩生長在有蔗糖的低氮培養基中的擬南芥植株葉片的衰老，而在其他供試條件下ABA促進擬南芥植株葉片的衰老。

圖3 通過最大光合效率測定擬南芥衰老Fig.3 A.thaliana senescence was determ ined in terms ofmaximum photosynthetic efficiency（Fv/Fm）

葉片衰老也可以通過葉綠素含量的方法進行檢測［13］。以野生型擬南芥（Col）為材料，在添加111 mmol/L蔗糖的不同氮含量（HN，LN）和不同質量濃度外源性ABA（0 mg/L、20 mg/L）的培養基上生長35 d后，測定葉綠素含量加以驗證。結果表明，在添加蔗糖的LN培養基上生長的野生型擬南芥葉綠素含量隨外源ABA的濃度增加而上升，相反，添加蔗糖的HN培養基上生長的野生型擬南芥葉綠素含量隨外源ABA的濃度增加而下降（圖4）。

為進一步驗證上述結果，測定了在添加蔗糖的低氮培養基上生長的擬南芥ABA敏感突變體（ahg3）葉片的衰老相關基因AtSAG12的表達量［9］。結果表明：在添加5μmol/L ABA和111 mmol/L蔗糖的LN培養基上生長ahg3的AtSAG12的表達量比在不加ABA的培養基上生長的明顯低（圖5）。

圖4 通過測定擬南芥葉綠素含量檢測擬南芥衰老Fig.4 A.thaliana senescencewas determ ined in terms of chlorophyll content

3 結論與討論

圖5 添加ABA（0μmol/L，5μmol/L）和蔗糖的LN培養基上生長35 d的ahg3葉片的AtSAG12表達量Fig.5 AtSAG12 expression of ahg3 p lants grow ing for 35 d on low-nitrogen medium added with sucrose and 0 or 5μmol/L ABA

脫落酸是植物響應外界生物脅迫及非生物脅迫的重要調節因子，如種子成熟和休眠、器官脫落、干旱抗性以及葉片衰老等［16］。植物葉片衰老最主要的特征是葉片黃化、葉綠素降解［17］、PSII原初光能轉化效率（Fv/Fm）下降［7］。本研究采用培養基中添加不同糖源和氮含量，測定Fv/Fm值、葉綠素含量和衰老相關基因AtSAG12［9］的相對表達量等方法，得到如下兩個結論：（1）低氮條件下蔗糖促進擬南芥葉片衰老，（2）外源ABA可延緩添加蔗糖的低氮環境下擬南芥的衰老。

ABA延遲氮缺乏條件下的衰老進程可能是由于促進葉綠素合成和抑制葉綠素的降解，延緩衰老也可能由于較高的培養溫度［18］。本試驗中低氮濃度和較高的溫度（25℃）所引起的ABA延遲衰老還有可能歸因于ABA具有保護植物免受高溫產生的活性氧（ROS）損傷的能力［18］。

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