M gO納米顆粒對油菜子葉外植體的影響

何曉蘭,Marian Brestic,2*,郭書巧,倪萬潮

（1江蘇省農業科學院經濟作物研究所，南京 210014；2斯洛伐克農業大學植物生理學院，尼特拉市 94976）

植物組織培養技術是染色體加倍、遠緣雜交種的拯救、突變體篩選、轉基因、種質資源離體保存、植物小孢子培養以及次生代謝積累等研究的重要試驗手段［1-4］。高效的愈傷誘導、體胚再生以及不定芽和不定根的再生等是利用植物組織培養技術得以順利完成這些試驗的前提［5-6］。為了提高植物外植體再生能力，研究者們從基礎培養基成分、外源激素水平和比例、促進植物分化的各類添加劑等方面對培養基組分進行了優化［7-8］。

MgO NPs是在藥劑、水源污染修復、涂料及半導體等中得到廣泛應用的環保納米材料［8-15］。該納米材料目前在生物學上的研究主要集中于菌類。在柵藻上亦有報道，100 mg/LMgO NPs處理柵藻可引起細胞的接觸性物理損傷，完全抑制了其生長和葉綠素的合成［16］。在前期試驗中，發現低濃度MgO NPs處理對油菜幼苗的生長未有明顯影響，但高于2.0 mmol/L會顯著抑制其生長（另文發表）。這些研究表明，高濃度的MgO NPs對生物的生長發育有明顯的毒害效應。該納米顆粒用于高等植物的研究，目前僅有一篇關于番茄的報道，MgO NPs處理番茄根部可誘導番茄根系產生活性氧，在其下胚軸和根中系統抗性相關基因GluA、水楊酸誘導基因PR1、茉莉酸誘導基因LoxA以及乙烯誘導基因Osm都得到上調，從而對細菌性枯萎病產生系統性抗性［17］。

油菜子葉外植體有較高的愈傷誘導和不定芽再生能力，對外源激素及AgNO3［18］等較為敏感，是較好的研究納米顆粒效應的載體。本試驗首次以油菜為研究對象，在其不定芽再生培養基（MS+4.5 mg/L 6-BA）的基礎上添加不同濃度的MgO NPs，研究其對油菜再生效率的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘藍型油菜品種‘寧油12’，由江蘇省農業科學院經濟作物研究所油菜研究室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌油菜種子苗的獲得

挑選健康飽滿的‘寧油12’種子，用70%的乙醇浸泡1 min，再用0.1%HgCl2滅菌15 min，然后在無菌條件下，用無菌水清洗3遍，播種于MS培養基［19］上，于25℃、光強600 mol/（m2·s）以及每天16 h光照下培養4—5 d。

1.2.2 子葉外植體不定芽再生培養

切取油菜帶柄子葉外植體，轉接于含0 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L、2.0 mmol/L、4.0 mmol/L、6.0 mmol/L、8.0 mmol/L和 10.0 mmol/L MgO NPs［＜50 nm particle size（BET），Sigma-Aldrich，China］的油菜不定芽再生培養基（MS+4.5 mg/L 6-BA）上。每個處理3瓶，每瓶10個外植體。置于與生長無菌苗（對照）相同的環境下培養。

1.2.3 不定芽和不定根再生頻率的統計

統計在添加不同濃度MgO NPs處理的培養基上的油菜子葉外植體每瓶長有不定芽和不定根的子葉外植體個數，以及每個子葉上再生出的超過2 mm長的不定芽個數，并稱量子葉外植體質量。不定芽（不定根）再生頻率=長芽（長根）子葉外植體個數/子葉外植體總數×100%每個子葉外植體平均不定芽數（個數）=不定芽總數/子葉外植體數

1.3 統計分析

用Excel 2003軟件對數據進行統計分析，并作圖。

2 結果與分析

2.1 M gO NPs對油菜子葉外植體不定芽再生頻率的影響

由圖1可見，在0—1.5 mmol/L內，隨著培養基中MgO NPs濃度的提高，油菜子葉外植體不定芽再生頻率逐步提高，在1.5 mmol/L時達最高值83.33%，較對照的36.67%有顯著提高；超過1.5 mmol/L，再生頻率急劇下降；達8.0 mmol/L時，油菜子葉外植體失去了不定芽再生能力。油菜單外植體再生不定芽個數亦在1.5 mmol/L時達最高值，明顯高于對照（圖2）。

圖1 不同MgO NPs濃度對油菜子葉外植體不定芽再生頻率的影響Fig.1 The effect of different concentration of M gO NPs on the rate of adventitious bud of cotyledon from Brassica napus L.

圖2 不同MgO NPs濃度對油菜子葉外植體不定芽再生個數的影響Fig.2 The effect of different concentration of M gO NPs on the number of adventitious bud of cotyledon from Brassica napus L.

2.2 M gO NPs對油菜子葉外植體不定根再生頻率的影響

由圖3可見，培養基中添加1.0 mmol/L和1.5 mmol/L MgO NPs，油菜子葉外植體不定根再生頻率均較對照有顯著提高，在1.0 mmol/L下，頻率達最高值63.33%。MgO NPs超過1.5 mmol/L，再生頻率急劇下降，達10.0 mmol/L時，油菜子葉外植體失去了根的再生能力，但4.0 mmol/L處理的不定根再生率顯著高于2.0 mmol/L處理的。

2.3 M gO NPs對油菜子葉外植體質量及形態的影響

由圖4可見，在添加0—10.0 mmol/L MgO NPs的培養基中，培養基中MgO NPs為0.5 mmol/L和1.0 mmol/L時，與對照相比對子葉外植體的質量沒有明顯差距；當MgO NPs增至1.5 mmol/L時，較對照有了顯著的提高；4.0 mmol/L處理時，外植體質量達到最高值4.84 g，顯著高于對照的2.72 g；隨著MgO NPs濃度的進一步提高，外植體質量逐步下降，但在MgO NPs為2.0 mmol/L時，再次出現與不定根再生力相應的變化，該處理的外植體質量低于更高濃度4.0 mmol/L的處理。

圖3 不同MgO NPs濃度對油菜子葉外植體不定根再生頻率的影響Fig.3 The effect of different concentration of M gO NPs on the rate of adventitious root of cotyledon from Brassica napus L.

圖4 不同M gO NPs濃度對油菜子葉外植體質量的影響Fig.4 The effect of different concentration of M gO NPs on the weight of cotyledon from Brassica napus L.

如圖5所示，隨著MgO NPs濃度的提高，子葉外植體逐步膨大增厚，達4.0mmol/LMgO NPs時最為肥厚，超過此濃度，外植體逐步白化并失去活力。

圖5 不同MgO納米顆粒濃度對油菜子葉外植體形態的影響Fig.5 The effect of different concentration of MgO NPs on the form of adventitious bud of cotyledon from Brassica napus L.

3 結論與討論

雖然MgO NPs在生物學上的研究已有一些報道［14-17］，但多集中于菌類，僅有一篇有關MgO NPs提高高等植物番茄抗病性的報道。本研究表明，培養基中MgO NPs達到1.5 mmol/L時可顯著提高油菜子葉不定芽的再生頻率和再生個數，且0.5—1.5 mmol/L時MgO NPs對外植體的不定根的再生也有明顯提高，較對照有更高的活力。在本試驗中，MgO NPs可能誘導了油菜外植體內源激素水平的提高，并改變了激素比例，這是否與水楊酸誘導基因PR1和茉莉酸誘導基因LoxA上調有關，有待進一步研究。

MgO NPs高于1.5 mmol/L時，對油菜再生能力有顯著抑制，且超過6.0 mmol/L時，表現較強的抑制作用，油菜子葉外植體失去了不定芽再生能力，僅有較低的不定根再生能力。當MS培養基中Mg2+高于28 mmol/L時，對擬南芥鎂會產生毒害效應，引起了一系列與ABA代謝有關基因的差異表達并促進了內源ABA的積累［20］。MgO NPs添加到培養基中，會有部分Mg2+釋放，從而提高培養基中Mg2+濃度［16］，釋放Mg2+的同時，會伴隨著OH的大量產生導致脂類、蛋白類及核酸的破壞［21］。納米顆粒尺寸減小時，其表面積會呈指數增長，更易與細胞產生物理或化學反應［22］。但在高濃度下，納米顆?？赡軙驁F聚效應［23］降低納米顆粒尺寸，從而降低對植物組織的傷害。在本試驗中，2.0 mmol/L的 MgO NPs較4.0 mmol/L的對油菜子葉外植體再生能力的抑制更為明顯，可能因團聚效應而緩解高濃度MgO NPs的毒害效應。

在植物組織培養和轉基因研究中，提高愈傷誘導率和不定芽再生頻率等是試驗成功的關鍵［5-6］，目前一般運用 6-BA、ZT、IAA等外源激素［7］，以及 AgNO3［18］等添加劑來提高植物外植體的再生力，這些組分價格較高且一些成分還對環境有潛在的污染，MgO NPs為無毒、無味的白色粉末，可提高植物對土壤有害微生物的抗性［17］，降低大氣中有毒物質［24-25］，以及水體污染凈化和吸附［13］等。運用物美價廉，且環境友好的MgO NPs來提高植物組培效率，是個很好的選擇。MgO NPs是否對其他種類的植物離體培養有較好的促進再生作用，有待進行下一步研究。

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