不同培養(yǎng)基質(zhì)和培養(yǎng)時間對蛹蟲草子實體生物量和蛋白質(zhì)氨基酸組成的影響

于榮利,高新華,張紅霞,唐慶九*

（1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點實驗室，國家食用菌工程技術(shù)研究中心，國家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點開放實驗室，上海 201403；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境保護研究所，上海 201403）

目前，蛹蟲草（Cordycepsmilitaris）已實現(xiàn)大規(guī)模人工栽培，因其具有極高的營養(yǎng)價值和保健功效，蛹蟲草及其產(chǎn)品倍受消費者青睞［1］。張顯科等［2］報道蛹蟲草中氨基酸種類齊全，且含量高。氨基酸是生物功能大分子蛋白質(zhì)的基本組成單位，是構(gòu)成動物營養(yǎng)所需蛋白質(zhì)的基本物質(zhì)，同時參與構(gòu)成酶、激素和維生素，在調(diào)節(jié)生理機能、催化代謝過程中起著十分重要的作用。近年來，人們在對天然藥物藥理活性物質(zhì)的探索中發(fā)現(xiàn)氨基酸與藥效存在著密切關(guān)系［3-6］。

孟慶繁等［7］對人工培養(yǎng)的蛹蟲草子實體及菌絲體中氨基酸含量與野生冬蟲夏草（C．sinensis）進行了比較分析，發(fā)現(xiàn)野生冬蟲夏草含有的各種氨基酸在人工培養(yǎng)的蛹蟲草子實體中均存在。林群英等［8］比較了廣東蟲草（C．guangdongensis）、冬蟲夏草和蛹蟲草中的水解氨基酸含量，發(fā)現(xiàn)水解氨基酸的總量以冬蟲夏草最高，蛹蟲草次之，廣東蟲草最低。陸艷艷等［9］報道蛹蟲草的固體培養(yǎng)殘基、子實體、菌絲體中的氨基酸含量分別為8.32%、21.68%和23.19%。目前，未見關(guān)于蛹蟲草不同培養(yǎng)基質(zhì)和培養(yǎng)時間對其子實體氨基酸組成、含量影響的研究。本試驗研究不同培養(yǎng)基質(zhì)以及不同培養(yǎng)時間對蛹蟲草栽培菌株CMH0810子實體生物量和氨基酸含量、組成的影響，以期為栽培獲得優(yōu)良蛹蟲草子實體及其深層次開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基質(zhì)

蛹蟲草（C．militaris）菌株CM-H0810由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境保護研究所蟲草課題組提供。

設(shè)置5個不同培養(yǎng)基質(zhì)處理，培養(yǎng)基A：麥粒；培養(yǎng)基B：90%麥粒，10%蠶蛹粉；培養(yǎng)基C：米飯；培養(yǎng)基D：90%米飯，10%蠶蛹粉；培養(yǎng)基E：蠶蛹。

1.2 培養(yǎng)基質(zhì)試驗

菌株CM-H0810在PDA培養(yǎng)基上活化后，分別轉(zhuǎn)接于裝有5種供試培養(yǎng)基（20 g）的玻璃培養(yǎng)瓶（直徑6.8 cm，高10.5 cm）中培養(yǎng)，菌絲培養(yǎng)、出草調(diào)控和采收參照文獻［10］進行。每種培養(yǎng)基20瓶。

1.3 培養(yǎng)時間試驗

每瓶裝20 g麥粒，接種后20 d出草，分別于第35、40、45、50、55天和第60天收獲子實體。每處理19瓶。

1.4 子實體生物量測定

樣品60℃烘至恒重后稱重，統(tǒng)計子實體生物量，粉碎備用。

1.5 氨基酸含量測定

氨基酸含量測定根據(jù)GB/T 5 009.124—2003［11］，略有改動。

1.5.1 樣品制備

精確稱取0.0001 g子實體粉樣品于水解管中，加入6 mol/L鹽酸15mL后，再加入新蒸餾的苯酚3—4滴，排盡管內(nèi)的空氣并充氮氣，封口，于（110±1）℃恒溫干燥箱內(nèi)水解22 h后，取出冷卻。將水解液過濾后，用去離子水多次沖洗水解管，將水解液全部轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶內(nèi)用去離子水定容，吸取1 mL轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶內(nèi)，采用真空干燥器在40—50℃干燥，殘留物用1—2 mL去離子水溶解后再干燥，反復(fù)進行2次，最后蒸干。用1 mL pH 2.2的緩沖液溶解，待測。

1.5.2 測定

準確吸取0.200 mL混合氨基酸標準溶液，用pH 2.2的緩沖液稀釋到5 mL，作為測定用的氨基酸標準溶液，用氨基酸自動分析儀（型號L-8900，日本Hitachi公司）以外標法測定試樣液的氨基酸含量。

樣品氨基酸含量計算公式：X=｛［C×（1÷50）×F×V×M］÷（m×109）｝×100

式中，X：試樣中氨基酸含量（mg/g）；C：試樣測定液中氨基酸含量［nmol/（50μL）］；F：試樣稀釋倍數(shù)；V：水解后定容體積；M：氨基酸分子量；m：試樣質(zhì)量（g）。

1.5.3 營養(yǎng)價值評價指標及計算

營養(yǎng)價值評價指標包括氨基酸評分（Amino acid score，AAS）［12］、氨基酸比值系數(shù)（Ratio coefficient of amino acid，RC）［13］和化學(xué)評分（Chemical score，CS）［14］。其中，AAS為 1 g待測蛋白中該必需氨基酸占 1 g標準蛋白質(zhì)中該必需氨基酸毫克數(shù)的比值。評分大于100，表明被測蛋白中該必需氨基酸的含量符合標準，蛋白質(zhì)的價值高；反之，若評分小于100，則表明該必需氨基酸的含量低于標準［13］。RC的意義是與模式氨基酸相當量的一份食物氨基酸的比值。RC數(shù)值大于和小于1都表示偏離氨基酸模式，RC＞1表示該氨基酸相對過剩，RC＜1表示該氨基酸相對不足，RC最小的氨基酸則是限制氨基酸［15］。CS用來評價待測蛋白中某種必需氨基酸的相對含量與標準雞蛋蛋白中該必需氨基酸相對含量的接近程度，CS值越接近100，則與標準雞蛋蛋白的組成就越接近，該蛋白的營養(yǎng)價值也就越高［13］。計算公式分別如下：

式中：Ax為試樣中某種必需氨基酸含量，mg/g；As為FAO/WHO標準模式某種必需氨基酸含量，mg/g；AASx為試樣中某種必需氨基酸的氨基酸評分；AASe為標準雞蛋蛋白中某種必需氨基酸的氨基酸評分；Ee為標準雞蛋蛋白中必需氨基酸的總含量，mg/g；Ae為標準雞蛋蛋白中某種氨基酸含量，mg/g；Ex為試樣中必需氨基酸的總含量，mg/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對蛹蟲草子實體生物量和蛋白質(zhì)氨基酸組成的影響

在相同栽培條件下，蛹蟲草子實體的生物量及氨基酸含量和組成比例均受培養(yǎng)基影響。生物量以培養(yǎng)基A（麥粒）最高，培養(yǎng)基B（麥粒+蠶蛹粉）其次，培養(yǎng)基E（蠶蛹）最低。用培養(yǎng)基C（大米）栽培的蛹蟲草子實體氨基酸總量、必需氨基酸含量以及必需氨基酸含量與氨基酸總量比值（E/T）最低。以培養(yǎng)基E（蠶蛹）栽培蛹蟲草，其子實體的氨基酸總量、必需氨基酸含量以及必需氨基酸含量與氨基酸總量比值高于其他培養(yǎng)基處理。大米或麥粒中添加蠶蛹粉后，栽培獲得的子實體中氨基酸總量、必需氨基酸含量，以及必需氨基酸含量與氨基酸總量比值均較未添加有所提高。

表1 不同栽培基質(zhì)對蛹蟲草子實體生物量、蛋白質(zhì)含量及氨基酸含量的影響Table 1 Effect of differentmedium on biomass，protein content and am ino acid content of C.m ilitias fruiting bodies

從表2可以看出，供試蛹蟲草子實體蛋白中Thr、Val、Phe+Tys和Lys的評分均大于或接近于100。5種培養(yǎng)基質(zhì)中，培養(yǎng)基D（大米+蠶蛹粉）栽培的子實體蛋白AAS較理想。供試蛹蟲草子實體蛋白中Met+Cys和Thr過剩，Val、Ile和Phe+Tys不足，其中Leu為限制氨基酸。5種培養(yǎng)基質(zhì)中，培養(yǎng)基A（麥粒）和D（大米+蠶蛹粉）栽培的子實體蛋白RC相對理想。供試蛹蟲草子實體蛋白中各氨基酸的CS均比較低，其中培養(yǎng)基A（麥粒）和C（大米）栽培的相對高些。綜合3個評價指標結(jié)果，認為培養(yǎng)基A（麥粒）和C（大米）栽培的蛹蟲草子實體蛋白質(zhì)的質(zhì)量較高。

表2 不同培養(yǎng)基栽培的蛹蟲草子實體中必需氨基酸的AAS、RC和CSTable 2 AAS，RC and CS of essential am ino acid in fruiting bodies of C.m ilitaris cultured by different com posts

2.2 培養(yǎng)時間對子實體氨基酸含量的影響

由表3可見，子實體在培養(yǎng)基A（麥粒）上生長的生物量隨培養(yǎng)時間延長逐漸增加，于接種后第55天達到最高值，之后趨于平穩(wěn)；氨基酸總量、必需氨基酸含量整體呈增加的趨勢，第60天時，氨基酸總量、必需氨基酸含量均最高。各氨基酸含量變化趨勢有所不同，其中Ser、Glu、Val、His含量隨栽培時間延長均表現(xiàn)出降-升-降-升的趨勢，Asp、Thr、Tyr、Orn和 Lys含量表現(xiàn)出先升后降再升趨勢，而 Arg、Gly、Ile和 Leu含量均表現(xiàn)出先降后升的趨勢。在6個供試培養(yǎng)時間中，樣品必需氨基酸含量與氨基酸總量的比值均為0.31，說明雖然部分種類氨基酸相對含量有所變化，但必需氨基酸和非必需氨基酸相對含量基本不變。

進一步分析數(shù)據(jù)（表4）表明，培養(yǎng)時間對蛹蟲草子實體蛋白中各考察氨基酸的AAS、RC和CS影響不明顯，AAS值均以Phe+Tyr的最高，RC值均以Thr的最高，且第一限制氨基酸均是Met+Cys。

表4 不同培養(yǎng)時間的蛹蟲草子實體中必需氨基酸的AAS、RC和CSTable 4 AAS，RC and CS of essential am ino acid in fruiting bodies of C.militaris cultured for different time

3 討論

在實現(xiàn)人工栽培的幾十種食用菌中，蛹蟲草的人工栽培技術(shù)已比較成熟，經(jīng)濟效益比較高。關(guān)于蛹蟲活性成分蟲草素、腺苷以及多糖的研究較多［16-19］，但很少有人關(guān)注同一菌株在不同培養(yǎng)基質(zhì)及不同培養(yǎng)時間條件下子實體成分含量的變化。本試驗對不同栽培基質(zhì)培養(yǎng)的蛹蟲草子實體生物量及其氨基酸含量進行比較，發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)基質(zhì)不僅對蛹蟲草子實體生物量有影響，對子實體中蛋白質(zhì)質(zhì)量也有明顯影響；蠶蛹栽培的蛹蟲草子實體生物量低，但氨基酸總量高；麥粒添加蠶蛹粉栽培蛹蟲草不僅子實體生物量高，氨基酸總量也較高。本實驗室還發(fā)現(xiàn)，蠶蛹栽培的蛹蟲草子實體中多糖、蟲草素含量顯著高于其他栽培基質(zhì)，麥粒+蠶蛹粉次之（另文報道）。綜上所述，蠶蛹栽培的蛹蟲草營養(yǎng)價值比較高；麥粒+蠶蛹粉栽培的蛹蟲草不僅營養(yǎng)成分、活性物質(zhì)含量較高，子實體生物量也較高，可以作為優(yōu)質(zhì)的保健品或藥品的原料。

菌株CM-H0810接種后第55天時，子實體生物量最高，第60天時氨基酸總量最高，而栽培時間對子實體蛋白質(zhì)質(zhì)量影響不明顯。本實驗室還發(fā)現(xiàn)第45天時多糖含量最高。因此，培養(yǎng)時間可依據(jù)產(chǎn)品用途來決定。另外，不同菌株生長特性不同，建議在大規(guī)模生產(chǎn)之前，針對產(chǎn)品開發(fā)應(yīng)用目標，進行適宜栽培基質(zhì)和采收時間的優(yōu)化試驗。

［1］曾宏彬，宋斌，李泰輝.蛹蟲草研究進展及其產(chǎn)業(yè)化前景［J］.食用菌學(xué)報，2011，18（2）：70-74.

［2］張顯科，劉文霞.蛹蟲草化學(xué)成份測定［J］.菌物系統(tǒng)，1997，16（1）：78-80.

［3］于秀軍，楯林義孝，郭力.氨基酸對NG2蛋白聚糖陽性神經(jīng)祖細胞增殖的影響［J］.腦與神經(jīng)疾病雜志，2010，18（6）：413.

［4］關(guān)學(xué)敏，張艷英，朱文進，等.氨基酸對雞肝堿性磷酸酶的影響［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)（科技版），2010（9）：78.

［5］劉政，楊紹斌，宋小美，等.氨基酸類營養(yǎng)對微生物生長及活性的影響［J］.黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（5）：13.

［6］李偉.氨基酸藥用市場初探［J］.上海醫(yī)藥情報研究，2002（1）：24.

［7］孟慶繁，林相友，李威，等.人工培養(yǎng)蛹蟲草與野生冬蟲夏草氨基酸含量的比較［J］.氨基酸和生物資源，2005，27（2）：33-34.

［8］林群英，李泰輝，宋斌，等.廣東蟲草與冬蟲夏草及蛹蟲草的成分比較［J］.食用菌學(xué)報，2009，16（4）：54-57.

［9］陸艷艷，邱細敏，黃思玉，等.人工冬蟲夏草不同部位氨基酸含量的測定［J］.食品科學(xué)，2011，32（8）：259-261.

［10］郭濤，張龍，王兵，等.不同培養(yǎng)基培育蛹蟲草中的蟲草素和腺苷含量測定［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2011，37（6）：1117-1122.

［11］中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標準化管理委員會.GB/T 5009.124—2003食品中氨基酸的測定［S］.北京：中國標準出版社，2003.

［12］BANO I，RAJARATHRAM S.Pleurotusmushroom as a nutritions foos.In the tropicalmushroom biological nature and cultivationmethods［M］.Hong Kong：The Chinese University Press，1982：363-380.

［13］侯飛娜，木泰華，孫紅男，等.不同品種馬鈴薯全粉蛋白質(zhì)營養(yǎng)品質(zhì)評價［J］.食品科技，2015，40（3）：49-56.

［14］譚愛華，劉發(fā)志，張曙光.紫陀螺菌蛋白質(zhì)的營養(yǎng)評價 ［J］.食用菌學(xué)報，2003，10（4）：24-28. .

［15］朱圣陶，吳坤.蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值評價：氨基酸比值系數(shù)法［J］.營養(yǎng)學(xué)報，1988，10（2）：187-190.

［16］周廣乙.蛹蟲草多糖和D-甘露醇的發(fā)酵研究［D］.長沙：中南林業(yè)科技大學(xué)，2015.

［17］康超，文庭池，康冀川，等.不同培養(yǎng)條件和前體對蛹蟲草液體發(fā)酵產(chǎn)蟲草素的影響［J］.菌物學(xué)報，2012，31（3）：389-397.

［18］郭濤，張龍，王兵，等.不同培養(yǎng)基培育蛹蟲草中的蟲草素和腺苷含量測定［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2011，37（6）：1117-1122.

［19］李晨曦.蛹蟲草有效成分的提取及保健食品的開發(fā)［D］.南昌：南昌大學(xué)，2013.