雙向電泳在植物蛋白質組中的應用

郭昆

隨著人類基因組計劃與10余種模式生物基因組全序列測定的完成， 基因組計劃的重心已逐漸由結構基因組研究轉移到功能基因組研究，生命科學隨之開始了一個新的紀元—后基因組時代， 蛋白質組研究則應運而生。1975年，OFarrell和Klose首先建立了等電聚焦/SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（IEF/SDS-PAGE）分離和分析蛋白質組分的技術。該技術的應用，使得多組分，低濃度蛋白的分離成為現實。

1 雙向電泳樣品制備技術

樣品制備是雙向凝膠電泳成功的關鍵， 直接影響到蛋白質組研究結果。其一般過程是：對細胞、組織等樣品進行破碎、溶解、失活和還原， 斷開蛋白質之間的連接鍵， 提取全部蛋白質， 除去非蛋白質部分。但溶解度差的蛋白質， 如膜蛋白、與膜相連的蛋白質以及來自具有高抗性組織的蛋白質， 需要添加離析劑、表面活性劑、兩性電解質和還原劑等以增加蛋白質的溶解度， 提高蛋白質的提取率。目前常用的離析劑有尿素和硫脈， 尿素是雙向電泳制備時最常用的變性劑， 硫脈則可以幫助許多難溶的蛋白質進行溶解；表面活性劑可消除蛋白質疏水基團之間的相互作用，增強蛋白質在其pI值處的溶解性，常用的非離子型去垢劑有CHAPS、CHAPSO、SB3-10和ASB-14等。在變性劑和表面活性劑聯用條件下，再加用還原劑可使已變性的蛋白質展開更完全，溶解更徹底，常用還原劑為含自由巰基的DTT以及不帶電荷的TBP。

王麗娟分別采用TCA-丙酮沉淀法和尿素一硫脲法提取菜籽種子蛋白，用Bradford法對所獲得的樣品進行蛋白定量后，發現尿素一硫脲法提取的蛋白質所得2-DE圖譜較模糊，低豐度蛋白質點數較少，橫豎紋干擾較大，分辨率較低；而TCA.丙酮沉淀法提取的蛋白質所得2-DE圖譜蛋白質點聚合較好，低豐度蛋白分離較好，蛋白點數顯著多于尿素一硫脲法，且蛋白點分布均勻，圖譜質量較好。張燕等對甘蔗蛋白質組雙向電泳技術優化結果，發現不同裂解液對蛋白質干粉的溶解能力存在明顯差異。

2 雙向電泳在植物蛋白質組中的應用

2.1 利用雙向電泳建立蛋白質組圖譜

利用雙向電泳的高分辨率和高重復性，建立不同物種植物的蛋白質組圖譜，尤其是對已經測序植物圖譜建立，可以更好的研究基因的功能，表達后的修飾等方面的研究提供有力的證據。植物的逆境脅迫可以是非生物脅迫的（abiotic） ， 即由過度或不足的物理或化學條件引發； 或者是生物的（biotic） ， 即由其他生物如病原菌所施加。通過對不同逆境脅迫下蛋白質組圖譜的建立可以在植物應答非生物脅迫包括鹽脅迫、溫度脅迫、干旱脅迫、氧脅迫、金屬離子脅迫和機械傷害等， 和生物脅迫， 如病菌侵害的蛋白質組學研究上提供一些借鑒。對于植物不同發育階段電泳圖譜的建立可以在不同時間和空間上了解植物發育過程中蛋白質是否表達和表達量的變化，更好的為植物不同階段發育的研究提供一種有效的方法。

2.2 差異蛋白質組學的研究

差異蛋白質組學，主要是篩選和鑒定不同種類或狀態下各樣本之間蛋白質組的區別與變化，實現對體系內代謝調控的動態監測，揭示細胞生理和病理狀態的進程與本質、對外界環境刺激的反應途徑以及細胞調控機制，同時獲得對某些關鍵蛋白的定性和功能分析，從而揭示機體對內外界環境變化產生反應的本質規律與基因組的穩定性相比，蛋白質則具有可變、多樣的特點，即使同一細胞，在不同生理或病理環境中，其蛋白表達也是不同的。蛋白質組的這種特點參與和影響著整個生命過程，這為差異蛋白質組的出現與興起奠定了邏輯基礎，差異蛋白質學研究的理論假設是承認某一細胞或組織在發生某種正常或異常變化時，其蛋白質組會發生相應的、有規律的改變。如能對此類蛋白進行驗證，進一步證明其與該變化密切相關，則可認為差異蛋白是這種變化的一類標志性蛋白。差異蛋白質組學研究由于并不要求捕獲“全部”蛋白，而重在找出有意義的差異蛋白，因而有著高得多的可實現性。這種觀點更傾向于把蛋白質組學作為研究生命現象的手段和方法。因此，它對園藝植物的發育和組織器官分化、突變體、對生物和非生物脅迫的適應機制、生理生化過程以及亞細胞結構研究等方面均有著重要的理論與實踐意義。

2.3 對于新蛋白的快速鑒定和分離

轉錄水平并不能完全反映基因表達，蛋白質是生命活動的承載者，也是大多數基因功能最終的呈現形式。因此，從轉錄水平上所獲取的有關基因表達的信息并不足以揭示該基因在細胞內的具體功能，還需要從蛋白質組方面進行深入研究，利用蛋白質組技術尋找與基因相關的蛋白質，進而通過數據庫查詢找到相應的基因，具有重要的理論和實踐意義。雙向電泳技術可以快速的鑒定低峰度蛋白，通過雙向電泳與質譜技術聯用，可以快速鑒定出電泳圖譜中各個點的蛋白質序列。再通過生物信息學手段，對鑒定蛋白在蛋白質數據庫中進行比對，就可以找到未鑒定過的蛋白。依據這種分離鑒定以及計算機技術的聯合應用，可以建立一種高效的、快速的蛋白質分離鑒定方法。對于低峰度蛋白表達的檢測和鑒定，具有重要意義。利用該技術可以進一步研究生物不同條件下代謝途徑，進而建立一種生物系統學的研究方法。

3 展望

蛋白質組學是一門新興的學科，雖然剛剛起步，但卻為大規模地直接研究基因功能提供了強有力的工具。目前，蛋白質組學在植物研究的多個領域得到初步應用。雙向電泳技術的建立和改進，使得蛋白質組學在基因功能研究、低豐度蛋白的研究和分子系統學的研究中起了重要作用。綜上所述， 將蛋白質組技術用于生物研究必將會促進未來生命科學的整體發展，而雙向電泳技術則是蛋白質組發展的有力促進劑。