含醇發酵乳的研制

賈夢凡 ， 呂 欣

（1.西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西師范大學 食品工程與營養科學學院，陜西 西安 710119）

目前發酵乳多由嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌等乳酸菌發酵而成。近年來，隨著人民生活水平的提高，人們對發酵乳的風味質地、新奇口感以及營養強化等方面有了更高的追求[1]。其中，開菲爾、酸馬奶酒等引起了廣泛關注[2]。酸馬奶酒是一種以新鮮馬乳為原料，自然發酵而成的具有一定保健功效，呈乳白色、均勻的含醇發酵乳飲料，其對心血管疾病、神經性疾病、消化系統疾病、糖尿病、肺結核及肺氣腫等都具有一定治療作用，并對某些癌癥有防治作用[3-5]。但是馬奶的季節性、來源少及低產量限制了酸馬奶酒的產業化發展[6]。

作者以牛乳為原料，利用從新疆酸馬奶中分離得到的乳酸菌及酵母菌混合發酵生產含醇發酵乳，優選乳酸菌和酵母菌并進行分子鑒定，進一步研究發酵溫度、發酵時間、接種體積分數及接種比例等對發酵乳的影響，建立以牛乳為原料生產含醇發酵乳的最優工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳酸菌培養基（MRS）[7]；酵母浸出粉胨葡萄糖培養基（YPD）[8]；脫脂牛乳：將脫脂牛乳粉溶于蒸餾水（1∶9）中攪拌均勻，加入5%白砂糖，在114℃條件下滅菌10 min后，迅速冷卻待用。乳酸菌及酵母菌：分離自新疆酸馬奶酒；白砂糖：市售一級；細菌基因組DNA提取試劑盒：OMEGA公司；酵母菌基因組DNA提取試劑盒：上海生物工程有限公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒：上海生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

722s可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司制造；Thermo Fisher高速冷凍離心機：美國熱電公司；3420A氣相色譜儀：北京北分瑞利分析儀器（集團）有限責任公司；PHS-3C精密pH計：上海日島科學儀器有限公司；MJ Mini梯度PCR儀：伯樂生命醫學產品（上海）有限公司；JY04S-3C凝膠成像系統：北京君意東方電泳設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳酸菌的篩選 將從酸馬奶中分離出的9株乳酸菌凍干菌種分別接種于MRS液體培養基中，活化兩代后保存于4℃MRS斜面待用。并取30 mL菌液于8 000 r/min離心3 min，倒去懸浮液，給沉在離心管底部的菌體加入20 mL生理鹽水，懸浮，再離心2 min后，將沉淀菌體接種于滅菌脫脂乳中。于37℃發酵至凝乳，再接種至100 mL滅菌脫脂乳中，通過感官評定篩選乳酸菌菌株進行后續乳酸菌與酵母菌混合發酵試驗研究。

1.3.2 酵母菌的篩選 將從酸馬奶中分離出的14株酵母菌凍干菌種分別接種于YPD液體培養基中，活化兩代后保存于4℃YPD斜面待用。并取30 mL菌液于8 000 r/min離心3 min，倒去懸浮液，給沉在離心管底部的菌體加入20 mL生理鹽水，懸浮，再離心2 min后，將沉淀菌體接種于滅菌脫脂乳中。于28℃發酵至產生大量氣泡，再接種至100 mL滅菌脫脂乳中，通過感官評定篩選酵母菌菌株用于后續乳酸菌與酵母菌混合發酵試驗的研究。

1.3.3 菌株DNA的提取、擴增及分子鑒定 乳酸菌的提取按照OMEGA細菌基因組DNA提取試劑盒操作，擴增參照文獻[9]操作；酵母菌的提取按照酵母菌基因組DNA提取試劑盒操作，擴增參照文獻[10-11]操作。

將電泳回收產物用冰袋保存寄到生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測得乳酸菌菌株16S rDNA序列及酵母菌菌株26S rDNA序列后，在NCBI上進行BLAST比對。利用MEGA6.0軟件繪制系統發育樹。

1.3.4 單因素和正交試驗 分別選取乳酸菌與酵母菌混合發酵溫度為 26、28、30、32、34、36、38 ℃，混合發酵時間為 8、10、12、14、16、18、20 h， 接種比例（乳酸菌/酵母菌）為 2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2，接種體積分數為 2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%；進行單因素發酵試驗，選出對試驗結果影響較大的指標參數進行正交試驗，從而優化工藝參數，得到較優產品。

根據單因素試驗結果設計因素水平表，做正交表進行正交試驗，優化含醇發酵乳的工藝參數。試驗因素與水平見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal design

1.3.5 分析方法 理化指標：pH用PHS-3C精密pH計測定[12]；滴定酸度用酸堿滴定法測定[13]；酒精度用氣相色譜法測定[14]；總酸及氨基酸態氮按照奶酒國標GB/T 23546-2009方法測定[15]；持水力按照文獻[16]的方法測定；還原糖質量濃度參照文獻[17]的方法測定。

感官指標：本產品感官評定方法采用綜合評分法，略有改動[18]。在有明亮的自然光、溫度為25℃的房間內依據產品特點進行感官評定，感官評分標準（滿分100分）見表2。

表2 含醇發酵乳感官評分表Table 2 Sensory evaluation of the fermented milk with low alcohol

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選

2.1.1 乳酸菌 取活化兩代后的9株乳酸菌MRS菌液30 mL，于8 000 r/min離心3 min，除去懸浮液后，給沉在離心管底部的菌體都加入20 mL生理鹽水，再離心2 min，將9種菌體分別接種于滅菌脫脂乳中，再將脫脂乳放置于37℃發酵24 h后，進行感官評定，見表3。選擇6號乳酸菌菌株進行后續試驗。

表3 乳酸菌發酵性能試驗結果Table 3 Results of lactic acid bacteria fermentation performance test

2.1.2 酵母菌 取活化兩代后的14株酵母YPD菌液30 mL，于8 000 r/min離心3 min，除去懸浮液后，給沉在離心管底部的菌體都加入20 mL生理鹽水，再離心2 min，將14種菌體分別接種于滅菌脫脂乳中，再將脫脂乳放置于28℃發酵24 h后，進行感官評定，見表4。

表4 酵母菌發酵性能試驗結果（脫脂乳中不含蔗糖）Table 4 Results of yeast fermentation performance test（no sucrose in the skim milk）

7號、9號、12號氣泡產生量適中，剎口感適中且品嘗時具有發酵產生的特殊風味，選擇7、9及12號酵母菌菌株進行下一步試驗。

對選出的酵母菌再進行試驗，觀察它們在含5%蔗糖脫脂乳中的發酵情況并進行品嘗和記錄，見表5。

表5 酵母菌發酵性能試驗結果（脫脂乳中含5%蔗糖）Table 5 Results of yeast fermentation performance test（5%sucrose in the skim milk）

7號氣泡產生量適中，有輕微剎口感且發酵風味濃郁，而9號、12號產生大量氣泡且有凝乳現象，搖動產生渣狀沉淀，剎口感過于強烈，使人有不適感，故選擇7號酵母菌菌株進行后續試驗。

2.1.3 菌株分子鑒定結果 優選出的乳酸菌分子鑒定結果為Lactobacillus crustorum，酵母菌為Trichosporon asahii。

對于面包乳桿菌（Lactobacillus crustorum）及阿氏絲孢酵母（Trichosporon asahii），目前多數研究報道只是將其從一些原料中分離鑒定出來，如面包乳桿菌（Lactobacillus crustorum）曾在酸面團中分離得到[19-20]；席琳喬等[21]發現青貯復合系主要由4種微生物組成，其中包括Lactobacillus crustorum；董小婉[22]等在新疆哈薩克族酸奶中也分離得到過Lactobacillus crustorum；王薇等[23]首次從清香型白酒釀造過程中分離獲得Trichosporon asahii，是對中國清香型白酒釀造酵母資源的補充；蘇俊等[24]從山西偏關縣的酸性稷米汁中分離出Trichosporon asahii，發現其有廣闊的pH耐受性。但是，關于菌株發酵條件等的研究報道很少，我們將Lactobacillus crustorum與Trichosporon asahii在牛乳中共發酵得到優化的含醇發酵乳，對菌種的發酵條件等作了初步探究，見圖1-2。

圖1 乳酸菌基于16S rDNA的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of the lactic acid bacterium according to 16S rDNA sequences

圖2 酵母菌基于26S rDNA的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the yeast according to 26S rDNA sequences

2.2 正交試驗結果與討論

在單因素試驗的基礎上，采用L9（34）正交試驗確定含醇發酵乳最佳生產工藝，優化發酵條件，結果見表6。

由表6可知，影響含醇發酵乳質量的因素主次順序為D﹥B﹥A﹥C，即接種比例﹥發酵時間﹥發酵溫度﹥接種體積分數。因此本試驗條件下確定的含醇發酵乳的最佳發酵條件組合為A3B1C1D3，即發酵溫度為37℃，發酵時間為14 h，接種體積分數為4%，接種比例（乳酸菌/酵母菌）為 2∶3。 閆彬等[25]研究初步確定了雙菌混合發酵的最佳培養條件，但其采用兩階段發酵，發酵工藝較為復雜，我們嘗試在發酵過程中同時加入乳酸菌與酵母菌靜置培養，使其自然發酵，所得優化工藝參數與馬榮山等[26]的研究結果相近。

表6 含醇發酵乳發酵工藝L9（34）正交試驗結果Table 6 Results of orthogonal experiments about optimization fermentation conditions of the fermented milk with low alcohol

2.3 含醇發酵乳產品理化指標

按照最優工藝參數進行發酵，所得含醇發酵乳的理化指標見表7。

與馬榮山[26]等比較，總酸質量濃度相近，酒精度較低，與黃翠姬[27]等比較，滴定酸度及酒精度偏低，與張和平[28]等比較，酒精度相近，氨基酸態氮質量濃度高。由于試驗方法及所用菌種的不同，所得產品理化指標的測定結果存在差異。

表7 含醇發酵乳理化指標測定結果Table 7 Results of physical and chemical indexes

3 結語

作者以牛乳為原料，利用分離自新疆酸馬奶中的乳酸菌及酵母菌，從中優選出一株乳酸菌及一株酵母菌并進行分子鑒定，乳酸菌為Lactobacillus crustorum，酵母菌為Trichosporon asahii，通過單因素及正交試驗優化含醇發酵乳的生產工藝，優化的工藝參數為：發酵溫度37℃，發酵時間14 h，接種體積分數 4%，接種比例（乳酸菌/酵母菌）2∶3，在該條件下測定了含醇發酵乳成品的理化指標。本研究所用菌株均分離自新疆酸馬奶，并將乳酸菌與酵母菌同時發酵，產品風味獨特，與酸馬奶接近，且生產工藝較簡單，易于工業化生產，具實用性。因此，本研究為含醇發酵乳的開發及產業化提供了一定理論依據。

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