青刺尖“金花菌”發酵茶的降血脂效果

劉 剛， 楊 妍， 胡婷婷， 鄧錢江， 張曉喻， 黎 霞

（四川師范大學 生命科學學院，四川 成都 610101）

高血脂癥是因體內血脂代謝異常而引發的一種慢性疾病[1]，也是引起脂肪肝、動脈粥樣硬化等心血管疾病的主要原因之一[2]。臨床上常用于治療高血脂癥的藥物主要是他汀類藥物，長期服用該類藥物對人體有一定程度的毒副作用[3]。

青刺尖茶是薔薇科李亞科扁核木屬植物青刺尖Prinsepia utilisRoyIe的嫩莖葉，按照綠茶的工藝制成的代用茶[4]，該植物始載于《滇南本草》，具有多種功效[5]。現代研究證明，青刺尖茶[6]與茯磚茶[7]均具有降低血脂的功效，茯磚茶的降血脂功效與其附生的優勢菌—“金花菌”的發酵作用有密切的聯系。有研究表明，該菌產生淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等酶，在改善茶葉本身滋味[8]的同時，飲用此茶可以調節人體的脂質代謝，維持血脂的平衡[9]。目前，“金花菌”發酵作用對青刺尖茶降血脂功效影響的研究，尚未見文獻報道。

將青刺尖茶經過“金花菌”發酵后，制備為代用茶，不僅符合綠色健康理念，滿足當今社會對食品多元化的要求，而且為青刺尖茶功能的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性昆明小鼠105只，體重18～22 g，合格證號SCXK（川）2013-24，成都達碩實驗動物公司提供。

1.2 動物飼料

普通飼料：成都達碩實驗動物公司；高脂飼料[5]配方為：基礎飼料75%、蛋黃粉15%、豬油10%。

1.3 儀器與設備

TC6010L全自動生化分析儀、TGL-20M臺式高速冷凍離心機、Multlskan Mk3型酶標儀、轉輪式切片機 （徠卡-2016）、TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機、BMJ-Ⅲ型包埋機、PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀、數碼三目攝像顯微鏡（BA400Digital）、圖像分析軟件Motic Images Advanced等。

1.4 實驗試劑

青刺尖茶：產自四川鹽源縣左所鄉；茯磚茶：中茶湖南安化茶廠有限公司；血脂康粉：北京北大維信生物科技有限公司；Mouse Apo-A1 ELISA kit：貨號 Rm1760XL；Mouse Apo-B ELISA kit： 貨 號Rm0743XL；Mouse LP-a ELISA kit： 貨 號Rm0742XL，規格96孔/盒，Abcam公司生產，北京永輝生物科技有限公司進口分裝。

1.5 茶湯制備

取真空密封包裝的青刺尖茶500 g，置于1 500 mL三角瓶，按25%含水量加蒸餾水125 mL，在121℃下滅菌20 min。用平板法[10]從茯磚茶中分離純化獲得“金花菌”，取其濃度[11]為 1.0×107個/mL 的孢子懸液1.0 mL分別接入滅菌的青刺尖茶，放28℃恒溫培養箱培養7d，然后將茶樣烘干，備用[12]。

稱取青刺尖茶樣75 g，以料液比1∶20加入1 500 mL蒸餾水[13]，90℃回流提取45 min，濾過液經減壓濃縮并定容至500 mL，得質量濃度0.15 g/mL的青刺尖茶樣茶湯。再按照灌胃劑量0.3 mL/20 g制備9.0、6.0、2.0 g/kg 的高、中、低劑量的發酵茶茶湯和9.0 g/kg干茶茶湯，備用。

1.6 小鼠高脂血癥模型的建立

小鼠適應性喂養3 d，105只小鼠稱質量后隨機分成基礎飼料組和高脂飼料組，兩組間小鼠體重的差異不顯著。高脂飼料組的90只小鼠飼喂高脂飼料[14]，其余15只小鼠飼喂普通飼料。28 d后禁食不禁水 12 h，斷尾取血[15-16]，37℃恒溫水浴 1 h[17]，3 000 r/min離心15 min分離血清[18]，再測定血清中的膽固醇 TC、TG、HDL-C、LDL-C。

1.7 實驗設計

確定造模成功后，再將高脂血癥小鼠隨機分成6組：青刺尖“金花菌”發酵茶高劑量組（9.0 g/kg）、中劑量組（6.0 g/kg）、低劑量組（2.0 g/kg）、青刺尖干茶組（9.0 g/kg）、血脂康組（0.3 g/kg）與模型組，各組間無差異性。處理組連續給藥28 d，空白組和模型組給予等量的蒸餾水，每三天稱一次體重，調整劑量。末次給藥后禁食不禁水12 h，先稱質量，再用戊巴比妥鈉麻醉，心臟取血，分離血清，測定方法同1.6。

1.8 測定方法

全自動生化分析儀測定膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）；試劑盒測定載脂蛋白-AI（Apo-AI）、載脂蛋白-B（Apo-B）、脂蛋白 A（LP-a）。 取血后，剝離小鼠的肝臟，用生理鹽水洗去污血，再用濾紙吸干、稱質量，計算肝臟指數[19]，肝臟指數=臟器質量/小鼠質量（g/g），然后，按病理檢驗SOP程序進行脫水、修剪、包埋、切片、HE染色、封片等，最后鏡檢。

1.9 統計與分析

用SPSS20.0對數據進行處理，組間比較用t檢驗，多重比較用LSD法[20]。

2 結果與分析

2.1 高血脂模型小鼠的建立

小鼠經3 d適應性飼養，再用不同飼料處理28 d，普通飼料、高脂飼料對小鼠的影響見表1。

表1 飼料對小鼠血脂生化指標和體重增長的影響Table 1 Effect of high-fat diet on blood lipid level in mice

從表1可看出：不同飼料處理28 d后，與普通飼料組比較，高脂飼料組小鼠的體重增長差異顯著（p＜0.05），同時，其 TC、TG、HDL-C、LDL-C 等生化指標均升高，具有極顯著的差異性（p＜0.01），表明小鼠高血脂癥模型建立成功。

2.2 發酵茶對高血脂小鼠血脂的影響

在灌胃期間，各組小鼠均取食正常，毛潔白而具光澤，無排稀便現象。藥物灌胃28 d后，各組小鼠血脂生化指標的影響見表2。

表2 發酵茶對高血脂癥小鼠血脂生化指標的影響Table 2 Effects of Prinsepia utilis fermented tea on blood lipid level in mice

從表2可看出：與模型組比較，青刺尖“金花菌”發酵茶的低中高劑量組血清TC、TG、HDL-C、LDL-C濃度均降低，其中，低劑量組的TC與TG濃度均有顯著差異（p＜0.05），而中劑量組的TC與TG濃度的差異極顯著 （p＜0.01）；低中高劑量組的HDL-C濃度均極顯著差異 （p＜0.01）；低劑量組的LDL-C濃度差異達到顯著（p＜0.05），而中劑量組的LDL-C濃度差異達到極顯著（p＜0.01）。與青刺尖干茶組相比，青刺尖“金花菌”發酵茶的高劑量組血清TC、TG、LDL-C濃度均降低。與陽性組比較，青刺尖“金花菌”發酵茶3個劑量組的血清指標差異性不顯著。

2.3 發酵茶對高血脂小鼠血清Apo-AI、Apo-B和LP-a的影響

經過“金花菌”發酵，對高血脂小鼠血清Apo-AI、Apo-B和LP-a的影響見表3。

表3 發酵茶對高血脂小鼠血清Apo-AI、Apo-B及LP-a的影響Table 3 Effects of Prinsepia utilis fermented tea on Apo-AI、Apo-B and LP-a

由表3可知：與模型組比較，各劑量組血清的Apo-AI均高于模型組，中劑量組的差異達到極顯著（p＜0.01），高劑量組差異顯著（p＜0.05）；各劑量組Apo-B均低于模型組，中劑量組差異達到極顯著（p＜0.01），低、高劑量組差異顯著（p＜0.05）；各劑量組的Apo-B/Apo-AI比值均低于模型組，中劑量組差異顯著（p＜0.05）；各劑量組LP-a均低于模型組。

2.4 發酵茶對小鼠體重及肝臟指數的影響

連續灌胃28 d，對小鼠體重及肝臟指數的影響見表4。

表4 發酵茶對小鼠體重及肝臟指數的影響Table 4 Effects of Prinsepia utilis fermented tea on body weight and liver index in mice

由表4可知：與空白組比較，模型組體重有一定的增長，但差異不顯著，各劑量組體重的增長量均有降低，且均達到極顯著（p＜0.01）。與空白組比較，模型組的肝臟指數極顯著升高（p＜0.01），青刺尖金花菌發酵茶各劑量組的肝臟指數差異不顯著。與模型組比較，發酵茶處理組的體重增長量、肝臟指數兩項指標均降低，體重增長量差異極顯著 （p＜0.01），低、中劑量組肝臟指數差異極顯著（p＜0.01），高劑量組差異顯著（p＜0.05）。而與陽性組和干茶組比較，各劑量組的肝臟指數差異均不顯著，而低劑量組的體重增長量低于陽性組和干茶組，且差異顯著（p＜0.05）。

2.5 發酵茶對小鼠肝臟組織的影響

青刺尖發酵茶對小鼠肝臟組織的影響，肝臟組織病理顯微結構見圖1。

參照文獻[21]，由圖1可知，空白組小鼠肝小葉結構完整，未見增生及假小葉形成，小葉中央靜脈未見淤血，肝細胞未見變性及壞死，也未見肝細胞增生、纖維化，肝細胞內及細小膽管內無膽汁淤積；模型組小鼠肝小葉結構欠清，肝細胞可見中度彌漫性水腫變性，可見脂肪變性；低、中劑量組小鼠肝小葉結構清晰，肝索呈放射狀排列，可見散在脂肪小滴肝細胞及輕度水腫變性；高劑量組、干茶組及陽性組水腫程度較低、中劑量組輕，可判斷有極少散在脂肪小滴的肝細胞。

圖1 小鼠肝臟組織的病理顯微結構(HE染色,x200)Fig.1 Microstructure of Pathology on the mice liver tissue(HE staining,x200)

3 結語

研究結果表明，經“金花菌”發酵，青刺尖發酵茶處理組小鼠的體重增長量明顯低于空白組和模型組，呈一定的劑量效應，其中，低、中劑量組控制體重增長的效果優于高劑量組，低劑量組體重增長量低于陽性組和干茶組，且差異顯著（p＜0.05）；發酵茶各劑量組的肝臟指數明顯低于模型組，而與干茶組、陽性組和空白組比較均無顯著差異。與青刺尖干茶相比，青刺尖發酵茶可極顯著降低TC、TG（p＜0.01），而顯著降低 LDL-C（p＜0.05），同時，可控制HDL-C的過度增長。青刺尖茶經此發酵，各處理組小鼠的血清LP-a、Apo-B/Apo-AI均低于模型組，其中，中劑量組差異顯著（p＜0.05）；而與干茶組、陽性組和空白組比較，各處理組均無顯著差異。

從小鼠的肝臟病理切片可知，青刺尖茶經“金花菌”發酵后，其高劑量組的肝臟組織只有極少、散在的脂肪小滴，肝細胞病變程度較低，且與陽性組和干茶組比較，均無顯著差異，說明青刺尖發酵茶可能具有控制高血脂小鼠肝臟發生脂肪積累性病變的功能。因此，經過“金花菌”發酵的青刺尖茶具有良好控制高血脂小鼠體重增長、降低血脂各項指標、控制肝臟脂肪積聚的功效，且這些作用呈現一定的劑量效應。同時，金花菌屬于安全性的菌類，在黑茶中最為常見，以此菌發酵青刺尖具有很高的安全性。

青刺尖茶經過發酵，其降脂效果更佳，控制體重增長更明顯，但要將其開發為新的功能性保健茶還需要對其風味等感官和理化指標進行進一步的優化及科學客觀的評鑒。

參考文獻：

[1]MI K M，JIYUN A，HYUNYU L.Anti-obesity and hypolipidemic effects of chufa （Cyperus esculentusL.） in mice fed a high-fat diet[J].Food Sci Biotechnol，2012，21（2）：317-322.

[2]YANG.Bioactivity-guided fractionation of the triglyceride-lowering component and in vivo and in vitro evaluation of hypolipidemic effects of calyx seu fructus physalis[J].Lipids in Health and Disease，2012，11（1）：38.

[3]YANG Yongge，WANG Zhanqing，JIANG Nan，et al.Statins adverse reactions[J].Herald of Medicine，2011，30（6）：817-820.（in Chinese）

[4]WANG Yujie，ZHANG Yi，DU Juan，et al.Study on the anti-inflammatory active constituents ofPrinsepia utilis[J].West China Journal of Pharmaceutcal Sciences，2006，21（2）：152-154.（in Chinese）

[5]蘭茂.滇南本草（第2卷）[M].昆明：云南人民出版社，1975：426.

[6]YANG Yan，LIU Gang，ZHANG Xiaoyu，et al.Effect of Prinsepia utilis tea on blood lipids in hyperlipidemic mice[J].Science and Technology of Food Industry，2015，36（13）：361-367.（in Chinese）

[7]DING Ting，LV Jiali.Research development of“Jinhua” fungi in Fuzhuan tea[J].Science and Technology of Food Industry，2012，33（1）：419.（in Chinese）

[8]LIU Zuoyi.The research progress of"golden flower"bacteria[J].Journal of Guizhou Tea，1993，2：33-35.（in Chinese）

[9]DENG Fangming，GONG Shuli，YANG Weili.Study on bioactivity of extracellular polysaccharide of eurotium cristatum by high throughput screening[J].Food&Machinery，2007，23（6）：48-51.（in Chinese）

[10]FENG Lingran，WANG Qiang，LUO Wei，et al.Screening and identification of strains with tea polyphenols conversion activity in pu-erh tea samples[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2014，33（7）：763-764.（in Chinese）

[11]無錫輕工業學院.微生物學[M].北京：中國輕工業出版社，1990：35-36.

[12]WEI Xiaohui.Effect of different inoculation dosage of eurotium cristatum on quality of green tea by solid-state fermentation[J].Guizhou Agricultural Sciences，2010，38（6）：82-83.（in Chinese）

[13]LIU Gang，FANG Yu，YANG Yan，et al.Basic study on antimicrobial actions of Prinsepia utilis’ tea[J].Food Industry and Technology，2014，35（14）：114-117.（in Chinese）

[14]WEN Jing，ZHANG Jing，SANG Tingting，et al.The possibility of using hyperlipemia mice as model for evaluating the function of declining blood lipids food[J].Food Science，2006，27（11）：479-482.（in Chinese）

[15]XIA Ying，WU Dan，XIE Yunpeng.Simple technology of draw blood[J].China Science and Technology Information，2008，12（8）：204.（in Chinese）

[16]TIANShunliang，QIANXuehua.Devicesandskillsusedinbloodcollectionbycuttingratstails[J].Chinese Journal of Comparative Medicine，2006，16（7）：420-421.（in Chinese）

[17]LI Longnu，WANG Yanyan，YI Caina，et al.Effects of lipoic acid on lipid metabolism disorder and oxidative stress on mice feed high-fat diet[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2013，32（6）：610.（in Chinese）

[18]LV Chunmao，LU Changyin，MENG Xianjun，et al.Effect of flat-european hybrid hazelnut oil on hyperlipemia of rats induced by high diet[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2014，33（3）：332.（in Chinese）

[19]PAN Xuediao，WANG Huihao，HE Bing，et al.Effect of water extracts from on momordica charantia blood lipids in hyperlipidemic mice[J].Chinese Joumal of Experimental Traditional Medical Fomulae，2013，19（14）：266.（in Chinese）

[20]謝龍漢，尚濤，蔡明京.SPSS統計分析與數據挖掘（第二版）[M].北京：電子工業出版社，2014.

[21]蘇寧，姚全勝.新藥毒理實驗動物組織病理學圖譜[M].南京：東南大學出版社，2005：75-90.