血紅密孔菌Pycnoporus sanguineus SYBC-L10產纖維二糖脫氫酶的發酵優化

馮圓圓， 唐明月， 管政兵， 蔡宇杰， 廖祥儒

（江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

纖維二糖脫氫（Cellobiose Dehydrogenase，CDH）可由降解木質素和纖維素的真菌產生，主要的生產者是擔子菌中的白腐菌[1]。大量研究表明[2-6]，白腐菌對纖維素有良好的降解效果。但是從自然界分離、篩選出的天然菌株往往產酶能力較低，因此有必要對其產酶的培養條件進行優化，通過優化提高酶的產量[7]。

CDH的相對分子質量大約為90 000，其中10 000為糖基，80 000為氨基酸，其中糖基中的糖多為甘露糖[8]。CDH是一個黃素血紅素蛋白，含有兩個獨立的基團：黃素基團和血紅素基團。黃素基團含有焦磷酸化酶即FAD；血紅素基團含細胞色素b。兩個基團通過15個氨基酸相連。CDH是一種對pH值和溫度穩定的酶。室溫下，在pH 3～10的范圍內24 h活力穩定。CDH可以氧化纖維二糖、纖維寡糖和纖維素。纖維二糖失去兩個電子被氧化的同時，CDH的FAD部分被還原。鐵血紅素基團得到一個電子生成亞鐵血紅素和黃素基。得到電子的CDH可以還原多種電子受體，如細胞色素c、二氯酚靛酚、Fe3+和氧氣。

CDH可增強纖維素酶對纖維素的水解作用[9]，由于酶產生的羥基可分解纖維素的微晶格從而分裂纖維素。CDH可還原木質素降解中產生的苯氧基，由此阻止木質素的重聚合[10]。CDH可減少纖維素酶的產物抑制作用。纖維二糖抑制降解木質素的白腐菌產生的纖維素酶，但是CDH催化纖維二糖所產生的纖維二糖內酯對纖維素酶并不產生抑制，所以培養基中加入較低濃度的CDH可幫助纖維素酶降解纖維素，加速纖維素的降解速率，但是高濃度的CDH對纖維素的降解有抑制作用[9]。CDH還可以防止纖維素的重聚合。加速纖維素的降解。在漆酶或者過氧化物酶的輔助下，CDH可連續催化乳糖產生乳糖酸，乳糖酸是一種高附加值的有機酸[11]。

作者所在實驗室從江蘇無錫惠山的朽木上篩選出一株能較好的產CDH的菌株，即Pycnoporus sanguineusSYBC-L10，并初步研究了其產CDH所需要的產酶培養基的條件，為今后的研究和工業應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌種

菌株Pycnoporus sanguineusSYBC-L10：作者所在實驗室保藏菌種。

1.2 主要材料及試劑

黃豆粉：將黃豆直接磨成粉狀，黃豆購于江蘇無錫歐尚超市；其他試劑均為國產分析純。

1.3 培養基

1） PDA 培養基（g/L）：新鮮土豆 200，葡萄糖20，瓊脂 20；pH 自然。

2）PDA 液態培養基（g/L）：新鮮土豆 200，葡萄糖20；pH自然。

3）液態發酵基礎培養基（L）：纖維二糖5 g，酵母膏0.1 g，磷酸氫二銨6 g，磷酸二氫鉀1 g，七水硫酸鎂0.3 g，氯化鈣0.08 g，七水硫酸鋅5 mg，四水硫酸錳1.5 mg，六水氯化鈷1.5 mg，七水硫酸亞鐵5 mg，VB11.5 mg[12]。

以上培養基均在115℃高溫滅菌20 min。

1.4 種子液的制備

將培養3 d的PDA斜面用無菌水將血紅密孔菌孢子洗下轉到事先滅菌的裝有玻璃珠的三角瓶中，在搖床上振搖30 min，然后配制成106個/mL的孢子懸浮液。將孢子懸液以體積分數4%接種于PDA液態培養基中，在30℃、200r/min條件下培養2 d，得到種子液[13]。

1.5 粗酶液的制備

將生長好的種子液以體積分數10%接種于液態發酵基礎培養基中，于30℃、200r/min條件下搖床培養7 d，得到含酶的發酵液。將發酵液用冷凍離心機以轉速8 000 r/min離心10 min，得到的上清液即為粗酶液[14]。

1.6 纖維二糖脫氫酶活力的測定方法

反應體系5 mL，包括纖維二糖（2 mmol/L）0.5 mL，DCIP（0.2 mmol/L）0.5 mL，氟化鈉（4 mmol/L）50 μL，乙酸-乙酸鈉緩沖溶液 （100 mmol/L，pH 4.5）2.25 mL，在520 nm處測定OD吸收值。以1 min內還原1 μmol DCIP所需要的酶量定義為1個酶活力單位（U），ε520nm=6.8 L/（mmol·cm）[8]。

1.7 Pycnoporus sanguineus SYBC-L10液態發酵產CDH條件優化

將培養好的種子液以體積分數10%接種至液態發酵培養基中，發酵條件為：溫度30℃，搖床轉速為200r/min，裝液量為50 mL培養基/250 mL三角瓶，發酵周期為7 d。

1.7.1 不同碳源對L10液態發酵產CDH的影響分別以不同的碳源（葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、馬鈴薯淀粉、微晶纖維素、玉米粉、麩皮、木屑、甘蔗渣）替代液態發酵基礎培養基中纖維二糖，其他條件固定，提取粗酶液測并測定CDH酶活力。

1.7.2 微晶纖維素與葡萄糖質量比對L10液態發酵產CDH的影響 微晶纖維素與葡萄糖之比分別以不同的比例（0∶10、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、10∶0）添加到發酵培養基中，探究復合碳源對L10發酵產CDH的影響，替他條件不變，提取粗酶液并測定CDH酶活力[15]。

1.7.3 不同有機氮源對L10液態發酵產CDH的影響 分別以不同的有機氮源（胰蛋白胨、魚粉蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉浸膏、酵母粉、黃豆粉、豆粕）替代液態發酵基礎培養基中的酵母膏，其他條件不變，提取粗酶液并測定CDH酶活力。

1.7.4 黃豆粉質量濃度對L10液態發酵產CDH的影響 分別添加不同質量濃度的黃豆粉（1、2、4、6、8、10、12 g/L）至碳源優化后的培養基，提取粗酶液并測定CDH酶活力。

1.7.5 不同無機氮源對L10液態發酵產CDH的影響 分別以不同的無機氮源（氯化銨、過硫酸銨、酒石酸銨、硫酸亞鐵銨、硝酸銨、磷酸二氫銨、硫酸銨、硝酸鎂、硝酸鈣、尿素、硝酸鐵）替代基礎發酵培養基中的磷酸氫二銨，對照為不加無機氮源，提取粗酶液并測定CDH酶活力。

1.7.6 磷酸氫二銨的質量濃度對L10液態發酵產CDH的影響 在碳源優化的基礎上，分別添加不同質量濃度的磷酸氫二銨（2、4、6、8、10、12、14 g/L）至培養基中，提取粗酶液并測定CDH酶活力。

1.7.7 最優碳氮源質量濃度組合的正交實驗設計確定發酵培養基中碳氮源的種類和濃度后，利用正交實驗確定最優的碳氮源組合。實驗的設計、數據結果分析利用軟件JMP完成，見表1。

表1 正交試驗的因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2 結果與討論

2.1 Pycnoporus sanguineus SYBC-L10液態發酵產CDH條件優化

2.1.1 碳源對Pycnoporus sanguineusSYBC-L10產CDH的影響 碳源是微生物生長過程中需求量最大的營養物質，不僅為微生物的生理活動提供能量還是細胞結構和代謝產物的主要構成組分。各種小分子碳源和大分子碳源對Pycnoporus sanguineusSYBC-L10產CDH的影響結果見圖1。

圖1 碳源對Pycnoporus sanguineus SYBC-L10產CDH的影響Fig.1 Effect of carbon sources on CDH production by Pycnoporus sanguineus SYBC-L10

對于Pycnoporus sanguineusSYBC-L10而言，不同碳源對其產酶的影響差異顯著（p＜0.05）；其中以微晶纖維素為碳源時，CDH的產量最高，因此選用微晶纖維素為發酵產酶培養基的大分子碳源。其中酶活幾乎為零的麩皮、木屑在圖中沒有顯示。

L10單獨以小分子糖類為碳源時其菌體生長良好，但是在一些大分子多聚物如微晶纖維素中生長不良，菌體量少。在培養基中添加一些小分子糖類如葡萄糖，可以先被菌體吸收，促進其快速生長，等菌體長到一定的程度在利用大分子的糖類碳源，這樣有利于增加CDH產量。所以，擬進一步考察大分子和小分子復合碳源對CDH合成的影響。

在小分子糖類中以葡萄糖為碳源時產酶量最高，并且相對其它小分子糖類來說，葡萄糖物美價廉，容易獲得，因此作者以葡萄糖作為CDH發酵的小分子碳源，研究與微晶纖維素作為復合碳源對菌體產CDH的影響。圖2顯示，微晶纖維素與葡萄糖質量比為1∶1時有利于產酶，CDH酶活力明顯高于單一碳源。

圖2 微晶纖維素與葡萄糖質量比對Pycnoporus sanguineus SYBC-L10產CDH的影響Fig.2 Effect of cellulose microcrystalline to D-glucose ratio on CDH production by Pycnoporus sanguineus SYBC-L10

2.1.2 有機氮源對Pycnoporus sanguineusSYBCL10產CDH的影響 氮源不僅是構成菌體細胞中核酸和蛋白質等重要物質的營養來源，同時還是代謝產物中氮元素的主要來源。氮源主要包括有機氮源和無機氮源兩種。不同的有機氮源對Pycnoporus sanguineusSYBC-L10液態發酵產CDH的影響見圖3。

從圖3可以看出，以黃豆粉為有機氮源時，發酵液中CDH酶活最高可達到500多個酶活單位，酵母粉、蛋白胨、豆粕與其相比，酶活力明顯偏低。以黃豆粉為氮源時CDH酶活顯著提高（p＜0.05），這可能與黃豆粉中富含的營養成分有關，黃豆粉中富含蛋白質和脂質，既可以滿足菌體生長的需要，又因為CDH為細胞周質酶，黃豆中的脂質可改變細胞膜的通透性，提高發酵液中CDH的產量，從而提高菌體的產酶量。

圖3 有機氮源對Pycnoporus sanguineus SYBC-L10產CDH的影響Fig.3 Effect of Organic nitrogen sources on CDH production by Pycnoporus sanguineus SYBC-L10

本研究確定有機氮源為黃豆粉，考察黃豆粉不同質量濃度（1、2、4、6、8、10、12 g/L）下對Pycnoporus sanguineusSYBC-L10產CDH的影響。如圖4所示，隨著黃豆粉的變化，CDH的產量明顯升高 （p＜0.05），當黃豆粉在培養基的終質量濃度為4 g/L時，此時CDH達到最大，最有利于CDH合成，此質量濃度下CDH的產量為570 U/L。隨著黃豆粉質量濃度的增大，CDH的產量下降明顯。所以黃豆粉的質量濃度為4 g/L，在此質量濃度下最有利于產酶。

圖4 黃豆粉質量濃度對Pycnoporus sanguineus SYBCL10產CDH的影響Fig.4 Effect of soybean meal on CDH production by Pycnoporus sanguineus SYBC-L10

2.1.3 無機氮源對Pycnoporus sanguineusSYBCL10產CDH的影響 由于微生物可以快速利用無機氮源，促進菌體的生長，而有機氮源含有菌體必需的生長因子為氨基酸發酵提供前體物質及輔酶，所以在以上優化的基礎上，研究不同無機氮源對Pycnoporus sanguineusSYBC-L10液態發酵產CDH的影響，結果見圖5。

圖5 無機氮源對Pycnoporus sanguineus SYBC-L10產酶的影響Fig.5 Effect of inorganic nitrogen sources on CDH production by Pycnoporus sanguineus SYBC-L10

由圖5可知，磷酸氫二銨和硝酸銨對Pycnoporus sanguineusSYBC-L10液態發酵產CDH有促進作用，其中磷酸氫二銨的促進作用較為明顯，而氯化銨、檸檬酸銨、磷酸二氫銨對菌體產酶影響不明顯，而硫酸銨和尿素對菌體產酶的抑制作用較明顯，所以選擇磷酸氫二銨為液態發酵產酶培養基中的無機氮源。

確定無機氮源為磷酸氫二銨，考察磷酸氫二銨的質量濃度（2、4、6、8、10、12、14 g/L）對Pycnoporus sanguineusSYBC-L10液態發酵產CDH的影響，結果見圖6。當磷酸氫二銨的質量濃度增大時，CDH的產量也隨之增大，并且在磷酸氫二銨的質量濃度為6 g/L時，此時CDH的產量達到最大；之后磷酸氫二銨的質量濃度增大，CDH的產量降低，說明高質量濃度的磷酸氫二銨不利于CDH的積累。因此磷酸氫二銨的質量濃度為6 g/L，此時產酶量最高可達到700 U/L。

圖6 磷酸氫二銨質量濃度對Pycnoporus sanguineus SYBC-L10產酶的影響Fig.6 Effect of （NH4）2HPO4on CDH production by Pycnoporus sanguineus SYBC-L10

2.1.3 最優碳氮源濃度組合的正交實驗設計 根據上述實驗結果，4個組分分別設定4個質量濃度，采用L16（45）正交試驗設計研究不同質量濃度的碳源和氮源組成對CDH合成的影響，試驗設計及結果見表2。

表2 L16（45）正交實驗結果及分析Table 2 Result and analysis of the L16（45） orthogonal array design

各因素對CDH發酵的影響程度排列為C＞B＞A＞D，即黃豆粉對CDH合成的影響最大，可見，黃豆粉是Pycnoporus sanguineusSYBC-L10 CDH液態發酵過程中的關鍵因素，黃豆粉中含有豐富的蛋白質和脂類，可為菌體生長和發酵提供有利的條件，并且黃豆粉中還含有豐富的維生素，可以為菌體合成CDH提供前體物質。碳氮源的最佳組合為微晶纖維素7 g/L，葡萄糖5 g/L，黃豆粉6 g/L，磷酸氫二銨2 g/L，在此條件下，CDH的產量最高。為了驗證預測結果，利用此條件進行重復實驗，得出的CDH酶活為1 245±35.78 U/L，比16個實驗的實驗值都高，所以這一實驗條件即為發酵產CDH的發酵條件。

3 結語

經研究確定，Pycnoporus sanguineusSYBC-L10液態發酵產CDH的發酵條件的優化，經過碳源中大分子碳源和小分子碳源的優化，使大小分子碳源組合成復合碳源使菌體產酶提高，經過氮源的優化，其中包括有機和無機氮源的優化，進一步提高了菌體的產酶量，通過優化發現現在菌體的產酶為1 245±35.78 U/L， 未優化時產酶為 39±4.78 U/L，提高了近32倍，已達到國內領先水平[7]。而Pycnoporus sanguineusSYBC-L10液態發酵產CDH的培養條件和CDH的酶學性質還有待進一步研究。

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