超高壓體系下皺褶假絲酵母脂肪酶的水解特性

杜煥梅， 繆 銘， 馮 骉， 江 波， 張 濤

（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122）

近年來，消費者對食品質(zhì)量的要求越來越高，超高壓技術(shù)作為一種替代熱處理的加工新技術(shù)，因其能夠更好的保持食品的風(fēng)味和營養(yǎng)成分越來越受到人們的關(guān)注，同時在酶學(xué)領(lǐng)域，超高壓技術(shù)也倍受矚目。壓力作為一項重要的熱力學(xué)參數(shù)，同溫度、pH等影響因素一樣，對調(diào)節(jié)酶催化行為起著至關(guān)重要的作用[1]。起初這項技術(shù)只是應(yīng)用于鈍化內(nèi)源酶，以改善其口感以及延長貨架期[2]，例如多酚氧化酶[3]、果膠甲酯酶[4]、過氧化物酶等，但是近幾年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)它可以作為一種穩(wěn)定、激活酶的工具[5]，這一發(fā)現(xiàn)使超高壓技術(shù)成為國內(nèi)外研究的熱點[6]。劉苗等報道了在200MPa，80℃下，IFTase催化水解菊糖的轉(zhuǎn)化率較0.1 MPa，60℃的轉(zhuǎn)化率提高了1倍多[7]。與此同時，有文章指出，脂肪酶在適宜壓力處理下，也有酶活增高、穩(wěn)定性增強的現(xiàn)象[8]。

脂肪酶（Lipase，EC.3.1.1.3）結(jié)構(gòu)獨特，可以在水相溶液中催化三酰甘油酯和水不溶性酯的水解，也可在有機溶劑中催化轉(zhuǎn)酯化、酯合成反應(yīng)，因此其在工業(yè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，例如食品風(fēng)味物質(zhì)及醫(yī)藥產(chǎn)品的生產(chǎn)、羧酸酯的合成、乳制品的加工等[9-11]。另外，脂肪酶還具有立體選擇性、底物專一性、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點。

雖然隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，已有酶學(xué)技術(shù)可以在分子層面上改善酶活，但是超高壓技術(shù)改善酶活有其獨特的優(yōu)勢，壓力處理僅使酶的體積發(fā)生改變，影響因素較單一，更有利于對酶的催化特性進行研究。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，脂肪酶在常壓下不能催化一些重要反應(yīng)，但在高壓下能順利進行[12]。目前有關(guān)超高壓加工技術(shù)對皺褶假絲酵母脂肪酶催化特性和動力學(xué)參數(shù)的影響的研究還比較少。作者旨在從宏觀上改善體系反應(yīng)條件，探討超高壓加工技術(shù)對催化活性的影響，研究超高壓處理水解反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)的變化，為皺褶假絲酵母脂肪酶的工業(yè)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試劑 脂肪酶（EC3.1.1.3）：別名三酰基甘油脂肪酶，來源于Candida rugosalipase typeⅦ，購自Sigma公司，酶活≥700 U/mg；對硝基苯酚棕櫚酸酯（p-NPP）及對硝基苯酚（p-NP）標(biāo)準(zhǔn)品：購自 Sigma公司；二甲亞砜、Triton-X 100、阿拉伯樹膠粉等其他相關(guān)試劑：分析純，均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器設(shè)備 MICRO FOODLAB FPG5740超高壓儀器：英國Stansted Fluid Power公司；HAAKE SC 100循環(huán)水浴：美國Thermo Scientific公司；EWS30空壓機：浙江永源機電制造有限公司；DK-8D電熱恒溫水槽：上海森信實驗儀器有限公司；UV-2102PC紫外-可見光分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；Delta 320s pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 脂肪酶水解酶活的測定 吸光度法測定脂肪酶活力[13-15]。

溶液A：對硝基苯酚棕櫚酸酯（p-NPP）溶于二甲亞砜，3 mg/mL；溶液 B：含 0.4 g/dL Triton-X 100和 0.1 g/dL阿拉伯樹膠粉、pH 7.5、50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液。按照A液∶B液=1∶9的比例，將A液緩慢加入B液中制成底物溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

取2.8 mL底物溶液，40℃預(yù)熱3 min后加入200μL酶液反應(yīng) 10 min，測定 OD410值，對照組加入滅活的酶液，每個樣品均測定3個平行樣。脂肪酶國際單位U定義為：在測定條件下，單位時間內(nèi)釋放1 μmol對硝基苯酚所需的酶量。本研究中相對殘余酶活為At/A0，其中A0為pH 7.5、溫度40℃、處理時間10 min的常壓酶活。

1.2.2 壓力對脂肪酶活性的影響 稱取脂肪酶2 mg，溶于50 mmol/L，pH 7.5的磷酸鈉鹽緩沖液，在40 ℃，0.1、100、150、200、250、300、400 MPa 下分別處理10 min，取出后根據(jù)1.2.1所述方法立即測定酶活。

1.2.3 溫度對脂肪酶活力的影響 稱取脂肪酶2 mg，溶于50 mmol/L、pH 7.5的磷酸鈉鹽緩沖液，在0.1 MPa 和 200MPa，35、40、45、55、65、70、80 ℃下分別處理10 min，取出后根據(jù)1.2.1所述方法立即測定酶活。

1.2.4 pH對脂肪酶活力的影響 配制50 mmol/L、pH 為 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 的磷酸鈉鹽緩沖液，稱取脂肪酶2 mg，分別溶于上述磷酸鹽緩沖液，在40℃、0.1 MPa和200MPa下處理10 min，取出后根據(jù)1.2.1所述方法立即測定酶活。

1.2.5 保壓時間對脂肪酶活力的影響 稱取脂肪酶2 mg，溶于50 mmol/L，pH 7.5的磷酸鈉鹽緩沖液，在 40 ℃，0.1 MPa和 200MPa下分別處理 5、10、15、30、60 min，取出后根據(jù)1.2.1所述方法立即測定酶活。

1.2.6 壓力處理后脂肪酶的回復(fù)性 稱取脂肪酶2 mg，溶于50 mmol/L，pH 7.5的磷酸鈉鹽緩沖液，在40℃、0.1 MPa和200MPa下處理10 min，取出后放置 0、0.5、1、2、4、6 h， 根據(jù) 1.2.1 所述方法立即測定酶活。

1.2.7 反應(yīng)速率常數(shù)的確定 按照1.2.1所述方法，測定反應(yīng) 3、6、9、12、15、18、21、24 min 時的產(chǎn)物濃度，繪制產(chǎn)物濃度對時間的曲線。反應(yīng)速率常數(shù)通過水解反應(yīng) 2、4、6、8、10 min 時的產(chǎn)物濃度對時間的曲線線性回歸得到。

1.2.8 動力學(xué)參數(shù)的確定 分別配制0.2、0.4、0.6、1、2、3 mg/mL的p-NPP溶液，在40℃和55℃下分別用0.1 MPa和200MPa處理10 min，按照1.2.7所述方法確定初始反應(yīng)速率。表觀米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax按照Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法線性得到。同時計算脂肪酶的轉(zhuǎn)換數(shù)Kcat以及催化效率 Kcat/Km。

2 結(jié)果與分析

2.1 壓力對脂肪酶活力的影響

壓力是影響酶活的重要環(huán)境因素之一，從圖1可以看出，在40℃條件下，200MPa處理10 min的脂肪酶酶活最高，是常壓的1.76倍。超過200MPa時，隨著壓力的上升，酶活開始下降，500 MPa處理后酶活已低于常壓。從本研究的結(jié)果來看，超過一定壓力酶會發(fā)生失活，而較低壓力處理，如200MPa能夠提高酶活。

圖1 壓力對脂肪酶活力的影響Fig.1 Effects of pressure on lipase activity

分析原因可能為，壓力的處理對分子間或者分子內(nèi)共價鍵的影響可能會導(dǎo)致酶活性中心位點更多的暴露出來（低壓升高酶活）與底物更好的結(jié)合，或者使酶活性位點更隱蔽（高壓抑制酶活）[16]，因此壓力對酶活的影響表現(xiàn)為：在較低壓力范圍內(nèi)壓力的增加使酶活提高，而超過一定值酶活開始緩慢下降，更高的壓力可能使酶失活。例如，當(dāng)脂肪氧合酶在200MPa，55℃條件下處理15 min時，酶活可以提高120%[17]。利用Candida antarctica lipase B在合成乙酸異戊酯時，在500 MPa下其催化效率可提高15倍[18]。

2.2 溫度對脂肪酶活力的影響

圖2顯示的是溫度對脂肪酶活力的影響，結(jié)果表明：200MPa處理時，40℃脂肪酶活性最高；而常壓時，50℃脂肪酶活性最高。當(dāng)溫度高于最適值時，隨著溫度的繼續(xù)升高，酶的催化活性開始下降。80℃時常壓脂肪酶相對殘余酶活僅為10%，200MPa則為34%。

從實驗結(jié)果來看，在200MPa壓力下，當(dāng)溫度小于40℃時，酶活隨溫度的升高而增大，40℃時，壓力和溫度為底物分子積累了較多能量，脂肪酶活性中心被激活，酶活達到最大值；當(dāng)溫度大于40℃時，維持酶活的共價鍵發(fā)生不利變化，酶活逐漸降低。張忠義等在100 MPa條件下處理胰脂肪酶的最適溫度為35℃，比常壓低2℃，有向低溫區(qū)移動的趨勢[12]。同時，在高溫區(qū)高壓處理能使脂肪酶酶活下降較慢，其原因可能是：一方面在酶的變性溫度下，適當(dāng)提高壓力可以保護酶的活性中心，從而減少酶的熱失活；另一方面合適的壓力可以加速反應(yīng)進程。這兩方面的綜合作用使得脂肪酶在高壓處理和較高溫度下仍能保持較高的酶活。有研究表明，溫度和壓力對酶的影響存在著相反的效果，在不超過一定壓力值的條件下，提升壓力可以使酶在較高溫度下熱穩(wěn)定性大幅度提高[19]。

2.3 pH對脂肪酶活力的影響

由圖3可以看出，隨著pH值的增加，酶活先上升后下降，常壓條件下最適pH為7.0，而200MPa處理后最適pH值增大到7.5，移動了0.5個單位。

分析其原因，一方面可能是超高壓處理導(dǎo)致酶的幾個重要氨基酸側(cè)鏈基團的解離狀態(tài)發(fā)生改變，對酶的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，例如導(dǎo)致酶分子部分氨基酸裸露，最適pH值發(fā)生偏移。另一方面可能是因為超高壓處理會引起酶分子氨基酸側(cè)鏈的移動，從而造成氨基酸之間非共價鍵的變化，而這些非共價鍵，包括靜電相互作用、氫鍵、疏水相互作用，對維持酶活性中心部位結(jié)構(gòu)、底物結(jié)合和轉(zhuǎn)化有關(guān)鍵作用[20-21]。有文獻報道，高壓可以增強氫鍵作用力[22]。例如，胰凝乳蛋白酶，經(jīng)超高壓處理后可以改變其活性部位氨基酸的靜電相互作用，從而改變酶活[23]。

圖3 pH值對脂肪酶活力的影響Fig.3 Effects of pH on lipase activity

2.4 保壓時間對脂肪酶活力的影響

在超高壓體系下，保壓時間也是影響脂肪酶酶活的重要因素。由圖4可以看出，經(jīng)200MPa處理10 min時，脂肪酶酶活最高。隨著處理時間的延長，酶活逐漸降低，酶變性程度增大。

圖4 保壓時間對脂肪酶活力的影響Fig.4 Effects of pressure holding time on lipase activity

由實驗結(jié)果可以推測，在一定壓力條件下，酶的激活與保壓時間有關(guān)，當(dāng)時間小于10 min時，超高壓處理并未使維持酶空間結(jié)構(gòu)的價鍵發(fā)生解離，同時能量得到積累，因而使酶的結(jié)構(gòu)更加緊湊，增強了酶的活性中心抗逆能力，使酶活提高；當(dāng)處理時間超過10 min后，隨著時間的延長，壓力使維持酶活性中心的非共價鍵遭到破壞，比如發(fā)生解離等，因而酶活降低。張忠義等發(fā)現(xiàn)，110 MPa處理豬胰脂肪酶，保壓10 min時酶活最高，隨著保壓時間延長，酶活逐漸減低[24]。

2.5 壓力處理后脂肪酶的回復(fù)性

從圖5可以看出，經(jīng)過200MPa或常壓處理后，撤去壓力在4℃下放置6 h，脂肪酶酶活均呈緩慢下降趨勢，200MPa時的酶活由176%下降到150%。原因可能是適當(dāng)強度的壓力會擠壓酶結(jié)構(gòu)但并不造成破壞，當(dāng)壓力撤去時，酶結(jié)構(gòu)會發(fā)生部分恢復(fù)。在本研究中，脂肪酶在200MPa時是激活狀態(tài)，卸壓后原來緊湊的結(jié)構(gòu)有所舒展，發(fā)生輕微的不利于與底物結(jié)合的變化，從而導(dǎo)致酶活降低。已有研究表明，經(jīng)較低壓力處理后，酶活的變化是可逆的，酶活力的回復(fù)需要幾個小時[25]。

圖5 壓力處理后脂肪酶的回復(fù)性Fig.5 Reversibility of lipase after the treatment of HHP

2.6 水解反應(yīng)進程曲線

由圖6可知，產(chǎn)物濃度對時間的線性回歸方程為y=0.005 3x+0.004 7，R2=0.998 3。結(jié)果證明，該水解反應(yīng)在0～25 min內(nèi)符合零級反應(yīng)動力學(xué)的規(guī)律，即反應(yīng)速率與濃度無關(guān)，因此初始反應(yīng)速率V0可由產(chǎn)物濃度對時間的線性回歸得到，亦即反應(yīng)速率常數(shù)k。

圖6 水解反應(yīng)進程曲線Fig.6 Hydrolysis reaction process curve

2.7 動力學(xué)參數(shù)的確定

脂肪酶在40℃和55℃條件下，經(jīng)0.1 MPa和200MPa 處理后的 Km、Vmax、Kcat、Kcat/Km值，見表 1。

表1 不同處理條件的動力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic parameters under different processing conditions

從表1可以看出，200MPa處理后，在40℃時，Km值的變化不大，而50℃時，Km值有所增大；Vmax值比常壓有一定提高，40℃時提高了67.8%，50℃時則為43.2%。Kcat的變化和Vmax變化相同，在40℃和50℃條件下，與0.1 MPa處理后的結(jié)果相比，200MPa處理后，Kcat/Km值逐漸升高。Kcat/Km表示催化效率，Kcat/Km值的增大，表明脂肪酶催化效率提高。

40℃時，200MPa處理后Km值幾乎不變，可能是因為在低溫區(qū)，脂肪酶沒有發(fā)生失活現(xiàn)象，酶的結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，受到壓力的影響較小。而50℃時，隨著壓力增加Km值增大，酶與底物結(jié)合能力下降，可能引起反應(yīng)速率的降低，但Vmax仍然增大，原因可能是壓力的升高同時促使反應(yīng)向合成產(chǎn)物的方向進行，有利于產(chǎn)物的釋放（限速步驟）[15]，從而削弱了底物與酶結(jié)合能力減弱的影響，因而表現(xiàn)為反應(yīng)速率及酶的催化效率提高。可見，酶與底物親和力與反應(yīng)速率不一定呈現(xiàn)正相關(guān)性。Eisenmenger在40℃、200MPa條件下處理CALB時，Vmax值比常壓升高10倍，同時酶與底物的的結(jié)合能力隨壓力增加減少了14倍[15]。

3 結(jié)語

皺褶假絲酵母脂肪酶在超高壓下的水解反應(yīng)條件得到優(yōu)化，在40℃、200MPa處理后的酶活增加，比常壓高76%；同時最適pH值從7.0增大到7.5；卸壓6 h內(nèi)，脂肪酶結(jié)構(gòu)發(fā)生部分恢復(fù)；高壓處理對 Km值影響在40℃和 50℃時表現(xiàn)不同；Vmax、Kcat、Kcat/Km值則隨壓力的增加而升高。這些實驗結(jié)果表明，適度的壓力可以改善酶催化的反應(yīng)條件，而超高壓處理引起的脂肪酶的一系列變化的可能機制需要進一步研究。總之，作為一種綠色環(huán)保技術(shù)，超高壓技術(shù)在生物轉(zhuǎn)化方面具有巨大潛力。

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