薰衣草產酚酸內生真菌的分離及產物初步鑒定

熊天真， 謝詩語， 薛亞娟， 白 蓉， 馮佳婷， 管政兵， 廖祥儒， 蔡宇杰

（江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

植物內生真菌是指在生活史的某一段時期或全部階段生活于健康植物各組織和器官內部，不引起被感染的宿主植物組織明顯癥狀改變的真菌[1]。植物內生菌具有多種作用[2]，內生真菌在植物體內具有較為穩定的生存空間，不易受到環境條件的影響，可以在植物體內獨立的分裂繁殖和傳遞，使之成為生物防治中具有潛力的微生物農藥、抗菌劑[3]、增產菌或作為潛在的生防載體菌而被加以利用[4]。內生菌能夠與宿主相互作用，產生具有生物活性的次級代謝產物[5]。李昆太等人從南方紅豆杉中分離出一株能夠產生紫杉醇的內生真菌，為解決紫杉醇生產帶來了新的思路[6]。因此對植物內生菌進行開發來生產一些天然產物具有重要的意義[7]。

酚酸類化合物是指苯環上有若干個酚羥基的一類化合物，在植物中分布廣泛，具有調節生長代謝、抵御病害入侵等多方面的功效，并且大多具有確切的藥理活性和藥用價值。研究表明，酚酸類化合物不僅具有顯著的抗氧化[8-9]、抗自由基、抗菌[10]消炎以及預防心血管疾病的作用，而且具有抗癌[11]、抗炎癥[12]和血小板凝聚[13]等功能。目前對植物提取物中總酚酸測定的研究較多[14-17]，但是對植物內生菌固態發酵產物總酚酸含量測定的研究還很欠缺。因此，作者對薰衣草內生真菌進行篩選分離，并對固態發酵產物進行初步分析，能夠對植物內生真菌的進一步開發提供理論和實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 植物材料 于春季在江蘇省無錫市采集的薰衣草及本實驗室種植的同品種薰衣草進行實驗。

1.1.2 培養基 篩菌培養基：PDA瓊脂培養基，添加氨芐青霉素，終質量濃度為0.1 mg/mL。種子培養基：PDA液體培養基。固態培養基：大米渣15 g（粒度 1～2 mm），5%葡萄糖 0.75 g，水 15 mL，pH 值自然，121℃滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 薰衣草各組織的表面消毒 分別取野外采集和人工種植的薰衣草各組織，用自來水沖洗干凈，用濾紙吸干表面的水分，用無菌水沖洗3次，再用75%乙醇浸泡3 min，無菌水沖洗4次，然后用3%的次氯酸鈉浸泡2 min，用無菌水沖洗4次，以最后一次沖洗液涂平板，在30℃條件下置于培養箱，檢查表面消毒是否徹底。

1.2.2 內生真菌的分離與純化 取表面消毒過的薰衣草各組織，分別放入滅過菌的研缽中，加入少量的無菌水，對其各組織進行研磨。取上清液進行梯度稀釋，涂布于加有氨芐青霉素的PDA瓊脂平板上，放入培養箱中培養2～7 d，待平板上長出菌落。用平板劃線的方法反復接種平板，直到分離出單一的典型菌落。

1.2.3 內生真菌的固態發酵 于三角瓶中加入種子培養基，滅菌。無菌條件下將純化的菌種轉入種子培養基中，置于30℃的搖床上，200r/min搖瓶培養3～5 d。待形成一定濃度的菌體小球后，將菌體轉入滅過菌的固態培養基中，攪拌均勻，然后置于30℃培養箱中培養10 d，獲得各菌株的固態發酵物。

1.2.4 對照品溶液的制備 精密稱取迷迭香酸標準品25 mg置于25 mL量瓶中，加入50%甲醇溶解并定容到刻度，得到1 mg/mL的迷迭香酸對照品溶液。

1.2.5 樣品溶液的制備 精密稱取發酵后的固態培養基5 g，加70%乙醇50 mL，于50℃的水浴鍋中振蕩提取12 h，抽濾定容提取液。取5 g滅過菌的固態培養基在相同條件下進行提取實驗，作為對照。

1.2.6 化學反應溶液的制備 精密吸取待測溶液0.5 mL，加無水乙醇至2.5 mL。分別加入0.3%十二烷基硫酸鈉溶液 1 mL、0.6%三氯化鐵 0.25 mL，0.9%鐵氰化鉀0.22 mL，搖勻，暗處放置5 min。再加入0.1 mol/L鹽酸溶液6 mL，搖勻，暗處放置20 min。

1.2.7 精密度實驗 精密吸取樣品溶液0.5 mL，按照含量測定方法，連續測定5次，結果相對標準偏差為0.85%，表明所采用測定方法的精密度良好。

1.2.8 穩定性實驗 精密吸取樣品溶液0.5 mL，按照含量測定方法，分別在 0，20，40，60，80 min 測定，結果相對標準偏差為2.05%，表明所采用的方法在80 min內穩定性較好。

1.2.9 重復性實驗 取同一批發酵的固態培養基，按照樣品溶液的制備方法制成樣品5份，按照含量測定方法進行測定，結果相對標準偏差為1.62%，表明所采用測定方法的重復性較好。

1.2.10 液相檢測方法 色譜柱：LaChrom C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相 A 和 B：分別是乙腈和甲酸溶液（0.1%）；流量：1 mL/min；檢測波長：280 nm；柱溫：35 ℃；進樣體積：10 μL。

1.2.11 質譜檢測方法 電離方式：采用負離子；毛細管電壓 3.5 kV，錐孔電壓 30 V，離子源溫度100℃，脫溶劑氣溫度300℃，脫溶劑氣流速300 L/h，碰撞能量6 eV，檢測電壓1 700 V。

2 結果與分析

2.1 薰衣草內生真菌分離結果

從人工種植和野生采集的薰衣草各組織中分別分離得到18和23株內生真菌。對所篩選的菌株在組織中的分布進行了統計。統計發現，從根部篩選出的菌株數相對較多，從莖和葉中篩出的菌株數比較接近，從花中篩選出的菌株數最少，內生菌群在各組織中的分布可能存在數量上的差異性，這種差異性可能與各組織所接觸的環境有關[18]。對比人工種植的薰衣草與野生的薰衣草中篩選出的菌株數，可以發現野生薰衣草中的內生菌群較為豐富，可能與野外的環境較為復雜有關[19]。

表1 薰衣草內生真菌各組織分布Table 1 Endophytic fungioflavender distribution organizations

2.2 產酚酸菌株的篩選及初步鑒定

為了探究菌株的產酚酸情況，對各菌株的固態發酵培養物提取后進行化學反應。結果顯示，從野生薰衣草中篩選菌株M1的發酵提取物明顯地顯現藍色，見圖1（b）。說明了M1為固態發酵產酚酸的菌株。對M1菌株形態進行觀察，發現菌落長出白色的菌絲，并且菌絲表面有凝集的小液滴，見圖1（a）。通過18S rRNA測序和BLAST比對，發現與其高度同源的基本為曲霉屬，見圖2。所以判斷其為曲霉屬。

圖1 菌株M1形態及菌株M1化學反應溶液Fig.1 Morphology of M1 and chemical reaction solution of M1

圖2 菌株M1系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of M1

2.3 檢測波長的選擇

取對照品及M1固態發酵提取物，按照上述化學反應方法進行處理，然后在200～900 nm范圍內測定吸光度，兩種溶液的光譜吸收圖譜基本一致，在720 nm處有最大吸收，因此選擇720 nm為測量吸光度的檢測波長。

圖3 迷迭香酸標準品和M1發酵提取液波長掃描Fig.3 Rosemary acid standard and M1 fermentation extract wavelength scanning

2.4 線性關系考察

精密吸取迷迭香酸對照品溶液 （質量濃度為1 mg/mL）1、2、2.5、3、4 mL 定容到 5 mL， 分別配置成0.2，0.4，0.5，0.6，0.8 mg/mL 的迷迭香酸標準品溶液，按照上述質量濃度測定方法，以顯色劑為空白，720 nm波長下測定吸光度，以吸光度為橫坐標，迷迭香酸對照品的質量濃度為縱坐標繪制標準曲線。得線性回歸方程為y=0.241 2x-0.008 6，R2=0.998 9，迷迭香酸質量濃度在0.2～1mg/mL呈良好的線性關系。

圖4 線性關系考察Fig.4 Linear relationship investigation

2.5 內生真菌M1固態發酵產物總酚酸質量分數的測定及加樣回收實驗

精密稱取同一批樣品5份，每份約1 g，精密加入約5 mg迷迭香酸對照品，按照1.2.5的方法制備樣品，然后利用化學反應的方法進行顯色反應，按照分光光度法，進行質量分數測定，計算回收率，見表2。

取M1菌株固態發酵后的培養基5 g，按照含量測定方法制備提取液。分別吸取0.5 mL提取液，按照上述化學反應方法顯色后測定吸光度，利用工作曲線計算出總酚酸的質量分數。可以看出3次測得的總酚酸平均質量分數為7.938 mg/g，RSD值為0.615%，在允許的誤差范圍內，見表3。作者以迷迭香酸為對照品，對M1固態發酵產物總酚酸進行了質量分數測定，該方法靈敏、快速、簡便、準確可靠。

表2 加樣回收實驗結果Table 2 Results of recoverie

表3 M1固態發酵產物總酚酸質量分數測定Table 3 M1 solid-state fermentation product total phenolic acid Determination

2.6 內生真菌M1固態發酵產物初步分析

按照上述高效液相色譜檢測方法對固態發酵產物進行檢測，結果見圖5。提取液在280 nm波長檢測下的成分很可能是含有苯環的酚酸類物質[20]。圖中有較強信號的兩種成分的保留時間分別為10.61、16.83min，現對這兩種物質進行分析。

200～600 nm波長掃描見圖6，保留時間10.61 min出峰的物質在310 nm左右存在最大的吸收波長，且此物質在280 nm檢測波長的液相中有比較強的信號，那么這種物質可能是含有共軛雙鍵的多酚類物質，同時在MS圖譜中還存在相對豐度較高的325.0的碎片峰。從圖7[M+H]-質譜圖可知，相對分子質量為326。此外，存在281.0的碎片峰，推測為[M+H-COOH]+碎片，說明化合物具有一個羧基。那么這種物質很可能是酚酸類的物質。

圖5 M1固態發酵提取液高效液相色譜圖及總離子流圖Fig.5 HPLC figure of M1 solid-state fermentation extract and total ion flow diagram

圖6 發酵提取物10.61 min處的波長掃描圖譜Fig.6 Wavelength scanning of fermentation extracts at 10.61 min

圖7 發酵提取物10.61 min處離子峰質譜檢測結果Fig.7 MS results（right） of fermentation extracts at 10.61 min

200～600nm波長掃描見圖8，保留時間16.83min出峰的物質在243、286 nm左右存在最大的吸收波長，此物質可能為含有苯環的物質[21]。從圖9[M+H]-質譜圖可知，相對分子質量為398。那么這種物質同樣可能是酚酸類物質。

圖8 發酵提取物16.83 min處的波長掃描圖譜Fig.8 Wavelength scanning of fermentation extracts at 16.83 min

圖9 發酵提取物16.83 min處離子峰質譜檢測結果Fig.9 MS results（right） of fermentation extracts at 16.83 min

3 結 語

植物內生菌是生產天然產物的一個龐大的資源[22]，通過微生物發酵法生產天然產物較傳統的植物提取有來源穩定以及產量大的優勢[23]。對內生菌株進行合理地開發，利用有著巨大的價值[24-25]，然而尋找到合適的菌株生產出對人類有作用的天然產物還需要大量的研究工作。

本研究顯示薰衣草各組織中存在著豐富的內生真菌。野外的環境復雜多變，而人工種植的薰衣草處在溫度與濕度相對穩定的環境中。同一植株不同的組織中內生真菌的數量存在著一定的差別。對各菌株的固態發酵物進行提取，通過化學反應的方法篩選出一株產酚酸物質的菌株。然后對其發酵產物進行總酚酸質量分數的測定以及對所產酚酸物質進行初步的分析。然而對于酚酸物質的結構和作用還有待于進一步的研究。

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