溫度對臨滄鐵殼麥種子生活力、發(fā)芽期α-淀粉酶活性及其基因表達的影響

周國雁，隆文杰，雷涌濤，陳 丹，蔡 青，伍少云

(云南省農(nóng)業(yè)科學院生物技術與種質資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)生物技術重點實驗室/農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質創(chuàng)制重點實驗室，云南昆明650205)

α-淀粉酶活性決定了種子萌發(fā)、淀粉降解和收獲前發(fā)芽(pre-harvest sprouting，PHS)的水平[1]。遲熟α-淀粉酶(late maturity a-amylase，LMA)是一種在籽粒成熟中后期合成的具有高等電點(isoelectric poin，PI)的α-淀粉酶，在一些文獻中也作熟前α-淀粉酶(pre-maturity a-amylase，PMA)[2-4]提及，是影響小麥加工品質和收獲前發(fā)芽的主要因素[2]。

小麥主要有3類α-淀粉酶同工酶[5]。第1類為TaAMY1[6]、AMY-1[1,7]或α-淀粉酶-1，由第6部分同源染色體長臂(6AL/BL/DL)的 amy1等位基因控制[1,7-8]，具有pH 6.3～7.5的高等電點[7,9]，主要存在于胚乳內(nèi)，在籽粒發(fā)芽前1～2 d開始表達[1]，也因此被稱為麥芽α-淀粉酶[7]。其活性約占發(fā)芽小麥籽粒總α-淀粉酶活性的84%[9]。第2類為TaAMY2[6]、AMY-2[1,7]或α-淀粉酶-2，存在于籽粒發(fā)育早期階段的果皮中，也因此被稱為發(fā)育或綠色α-淀粉酶[8]，由第7部分同源染色體長臂(7AL/BL/DL)的 amy2基因支配[1,7-8]，具有pH4.9～6.0的低等電點，在發(fā)芽期的第3天[1]或第5～6天[10]開始表達，對α-淀粉酶-1起輔助作用。這兩類是遺傳和功能已比較清楚、被廣泛描述的主要類型[6]。第3類是TaAMY3[6]，出現(xiàn)在籽粒發(fā)育的全過程，由第5染色體編碼，但對籽粒發(fā)芽的作用尚不清楚[10]。谷物籽粒的α-淀粉同工酶活性由環(huán)境、遺傳因子以及二者的相互作用共同影響[8]。在環(huán)境因子中，溫度的影響可能是最大且有害的[8]。在低溫緩慢干燥條件下，溫度僅能提高收獲前即將成熟小麥的籽粒α-淀粉酶含量，而生理成熟(physiological maturity，PM)后高溫可降低小麥籽粒的α-淀粉酶活性[11]。溫度也能強烈地影響小麥籽粒萌發(fā)過程中α-淀粉酶活性及其基因的相對表達量[12]，即α-淀粉酶活性和其基因表達量不僅與籽粒發(fā)芽時的溫度呈正相關，而且發(fā)芽小麥籽粒的α-淀粉酶活性還與籽粒發(fā)芽率呈顯著或極顯著正相關[13-14]。

臨滄鐵殼麥是隸屬云南小麥亞種(Triticumaestivumssp.yunnanense)的一個原始農(nóng)家品種，具有典型云南小麥亞種的斷穗、帶殼或包殼特征，可能還帶有強休眠和穗發(fā)芽抗性[15]基因，是改良和提高現(xiàn)代小麥生產(chǎn)品種穗發(fā)芽抗性的重要優(yōu)質基因資源。因此，本研究采用實時定量PCR技術，研究經(jīng)不同溫度貯藏后，臨滄鐵殼麥發(fā)芽期的α-淀粉酶活性及其編碼基因表達量與貯藏溫度、貯藏時間及生活力指標間的關系，可為有效保存、保護和再利用該小麥種質資源提供酶學參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物種子及貯藏處理

試驗用植物種子為2005年繁殖、2006年1月保存于-7.5±2.5 ℃低溫種質庫的臨滄鐵殼麥種子。其入庫時種子量約300 g，發(fā)芽率達97%。該試驗材料為云南小麥亞種內(nèi)的農(nóng)家品種，于20世紀70年末80年代初期考察收集于云南省原臨滄地區(qū)臨滄縣(現(xiàn)臨滄市臨翔區(qū))，穗部特征為穎殼無毛、無芒、白殼、紅粒，在云南省的保存編號為云0006，國家統(tǒng)一保存編號則為XM0927。2016年1月初從種質庫中取出已貯藏10年左右的臨滄鐵殼麥種子，用電子天平將其平均分成25份，每份約12 g，密封于10 cm×15 cm的鋁泊袋，并保留少量種子用于檢測其出庫時的發(fā)芽率(隨后測得為91%)。然后，將分裝好的種子分別貯藏在低溫1(LT1，-7.5±2.5 ℃，低溫種質庫)、低溫2(LT2，7.5±2.5 ℃，低溫種質庫)、室內(nèi)溫度(AT，木質柜)和高溫(HT，40±1 ℃，恒溫箱)4種溫度條件下。但是，由于保持在低溫環(huán)境下的種子在短時間內(nèi)的生活力變化會很小，因此只在AT、LT1和LT2三種溫度條件下各放置5袋種子，而將另外10袋種子暫留在溫度LT1的種質庫內(nèi)保存至高溫貯藏試驗開始。高溫貯藏試驗(2016年7月11日)開始時，將存放于LT1溫度下的10袋種子轉移至溫度HT的恒溫箱內(nèi)貯藏。

1.2 種子生活力指標測定

按照農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程(GB/T3543-1995)和貯藏種子的不同溫度對貯藏后的種子進行定期發(fā)芽試驗，以觀測其生活力的變化。其中，貯藏在HT條件下的種子每7 d一次，貯藏在其他3種溫度條件下的種子每2或3月1次。每次發(fā)芽試驗用1袋種子，重復4次，每100粒種子為1次重復。種子在20±1 ℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)7 d，每天10:00 前記錄前一天發(fā)芽種子粒數(shù)，發(fā)芽試驗結束時，每個重復隨機測量10苗的苗高(芽長+根長，cm)。計算發(fā)芽勢(3 d內(nèi)的發(fā)芽種子數(shù)/N×100%)、發(fā)芽率(7 d內(nèi)的發(fā)芽種子數(shù)/N×100%)、發(fā)芽指數(shù)[GI=∑(Gi/Di)]、發(fā)芽速率(GR=[(7×N1+ 6 ×N2+ … + 1×N7)/(7 ×N)][16-17]和活力指數(shù)(VI=GI×S)5項生活力指標。式中，N為參試種子總數(shù)，Gi為第Di天發(fā)芽的種子數(shù)，i=1、2、3…7，N1、N2、N3…N7為第1、2、3…7天發(fā)芽的種子數(shù)，S為平均苗高。

1.3 α-淀粉酶液提取與活性測定

1.3.1 α-淀粉酶液提取

取上述發(fā)芽7 d的種子，吸干表面水分，摘除根芽，稱取1 g，置于研缽內(nèi)，加2 mL蒸餾水，研磨至勻漿，然后轉入離心管，4 000 r·min-1離心10 min。取上清液，用蒸餾水定容至25 mL。

1.3.2 麥芽糖含量測定

由于發(fā)芽試驗設置的發(fā)芽時間不同，因此在測定α-淀粉酶活性時需根據(jù)發(fā)芽種子批次單獨配制麥芽糖標準溶液，并據(jù)此計算溶液的吸光值和麥芽糖含量，為每批發(fā)芽種子建立共享的吸光度(y)與麥芽糖含量(x)的線性回歸方程。然后，再以此回歸方程計算出待測樣品的實際麥芽糖含量，并用其估算待測樣品的α-淀粉酶活性。因此，試驗期間共獲得6個方程：

y1=-0.021+0.265x(R2=0.995，P=0.006<0.01)

y2=-0.032+0.306x(R2=0.987，P=0.000<0.01)

y3=-0.021+0.283x(R2=0.997，P=0.000<0.01)

y4=-0.025+0.288x(R2=0.995，P=0.000<0.01)

y5=-0.027+0.276x(R2=0.994，P=0.007<0.01)

y6=-0.035+0.290x(R2=0.991，P=0.000<0.01)

1.3.3 α-淀粉酶活性測定

采用3, 5-二硝基水楊酸法測定α-淀粉酶活性。向4支試管(其中1支為對照，另3支為待測)各加入α-淀粉酶原液1 mL，70 ℃水浴15 min，取出用流水迅速冷卻；每管加入pH5.60的檸檬酸緩沖液1 mL，并向對照管加入0.4 mol·L-1氫氧化鈉溶液4 mL，各管均于40 ℃水浴15 min；每管都加入經(jīng)40 ℃預熱的1%淀粉溶液2 mL，搖勻，并立即放進40 ℃恒溫水浴5 min；迅速向每管中加入0.4 mol·L-1的氫氧化鈉溶液4 mL；分別取每管中的酶促反應液2 mL轉至25 mL試管，并加入3,5-二硝基水楊酸2 mL，沸水浴5 min。取出冷卻，以蒸餾水稀釋至25 mL，通過紫外分光光度計測量520 nm的吸光值。

待測樣品的吸光值為其實測值與對照樣品的實測值之差(A)。將A值代入上述各回歸方程，求得各待測樣品的實際麥芽糖含量。

將每克樣品孵化5 min后降解產(chǎn)生1 mg麥芽糖作為1單位的α-淀粉酶活性。即待測樣品α-淀粉酶活力(mg·g-1)=通過回歸方程求得的麥芽糖含量(mg)×淀粉酶原液總體積(mL)/樣品重(g)×5 min×顯色用酶液體積(mL)。

1.4 α-淀粉酶基因實時定量PCR檢測

1.4.1 RNA的提取與反轉錄

取上述發(fā)芽的麥苗幼葉提取RNA。總RNA的提取按照寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)的試劑盒(TaKaRaMiniBEST Universal RNA Extraction Kit)使用指南操作。cDNA合成則按該公司的反轉錄試劑盒PrimeScriptTmⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit使用說明操作，反轉錄后的cDNA于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 定量PCR引物篩選

為研究臨滄鐵殼麥種子發(fā)芽期的α-淀粉酶基因的相對表達量，對已報道[1,8,12]的目標基因 amy1-2、 amy1和 amy2及其內(nèi)參基因actin、 α-Tubulin等引物，以及周飛[18]設計的引物，共12對引物(表1)進行篩選，最終篩選出用于臨滄鐵殼麥α-淀粉酶基因表達研究的PCR引物：內(nèi)參基因為小麥actin基因[19]的引物，目標基因 amy1的引物為amy1-RT， amy3的引物為AMY-2[18](由于引物AMY-2的序列是根據(jù)GenBank編號x05809.1的α-淀粉酶基因序列設計的，而這個編號在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/x05809.1中對應的α-淀粉酶基因是 amy3，所以，由AMY-2檢測到的結果是基因 amy3的相對表達量)。

表1 用于研究小麥α-淀粉酶基因表達量的引物和序列Table 1 Primers and their sequences used for expression analysis of a-amylase gene in wheat

1.4.3 定量PCR擴增

反應采用寶生物工程(大連)有限公司的試劑盒[SYBR○RPremix Ex TaqTM(TIiRNaseH Plus)]。反應體系20 μL：SYBR○RPremixExTaq(TIiRNaseH Plus)(2×)10 μL，PCR Forward Primer(10 μmol·L-1) 0.4 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol·L-1) 0.4 μL，ROX Reference DyeⅡ(50×)0.4 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 6.8 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，40個循環(huán)；60 ℃ 34 s。

1.5 數(shù)據(jù)處理

α -淀粉酶基因相對表達量2-△Ct和2-△△Ct值按文獻[20]的方法計算。采用IBM SPSS statistics 19統(tǒng)計軟件的單因素方差和雙變量相關分析進行相關數(shù)據(jù)的差異顯著性分析與檢驗。

2 結果與分析

2.1 種子生活力隨貯藏溫度和時間的變化

種子生活力指標(如發(fā)芽勢和發(fā)芽率等)隨種子貯藏溫度的升高和貯藏時間的延長而降低，種子逐步死亡。但在不同貯藏溫度下，種子生活力的下降速度明顯不同(表2)。在LT1和LT2條件下，5項生活力指標雖然都有隨貯藏時間的延長而逐漸降低的趨勢，但在63、189、252和365 d 4個貯藏時間段間的變化均不明顯(F=0.393～2.555，P=0.128～0.761)。在AT條件下，除發(fā)芽勢在不同貯藏時段間的變化達到極顯著差異(F=7.675，P=0.004<0.01)外，其他4項指標的變化均不明顯(F=1.335～2.056，P=0.162～0.323)。但是，在HT條件下，發(fā)芽率在7、14、21、28、35、42、49、56、63和70 d 10個貯藏時段間的差異都達到了顯著水平(F=2. 727，P=0.029<0.05)，而另外4項指標則都達到了極顯著水平(F=3.887～7.308，P=0.000～0.005<0.01)。由此說明，貯藏種子的溫度越高，生活力指標下降越快，種子保持高生活力的貯藏時間也越短。

2.2 α-淀粉酶活性隨種子貯藏溫度和時間的變化

由圖1可知，在相同貯藏時間內(nèi)，除第1貯藏階段(63 d)種子的α-淀粉酶活性在LT1、LT2和AT3處理間的差異不明顯外(P>0.05)，另外3個階段(189、252和365 d)α-淀粉酶活性至少在2種處理間存在顯著差異(P<0.05)；除第4階段(365 d)外，其他3個階段的α-淀粉酶活性隨種子貯藏溫度的升高呈逐步上升的趨勢。在相同的貯藏溫度下，低溫貯藏條件下種子的α-淀粉酶活性有隨貯藏時間延長而逐漸升高的趨勢；在AT條件下貯藏至第3階段(252 d)，或在LT1、LT2條件下貯藏至第4階段(365 d)的種子，其α-淀粉酶活性較前幾個貯藏時期有顯著升高；而貯藏在HT條件下的種子α-淀粉酶活性隨貯藏時間延長呈由高至低的顯著下降，且在貯藏至42 d及以后趨于穩(wěn)定。與在LT1 、LT2和AT條件下貯藏至第2階段(189 d，2016年1月初至7月11日，此日為高溫貯藏試驗起始日)及第3階段(252 d，2016年1月初至2016年9月12日，此日為高溫貯藏試驗結束日)的種子相比，在HT溫度條件下貯藏7～70 d的種子，其α-淀粉酶活性大都出現(xiàn)了顯著或極顯著(P<0.01)地上升，尤其是貯藏7～28 d的種子，其α-淀粉酶活性與貯藏在另外3種溫度條件下的第2、第3階段的種子的α-淀粉酶活性的差值達到4.239～12.810 mg·g-1。

表2 不同貯藏溫度和時間下臨滄鐵殼麥種子的生活力指標Table 2 Viability indices of Lincang hulled wheat seed stored at different temperature and time

LT1:低溫1(-7.5±2.5 ℃)；LT2:低溫2(7.5±2.5 ℃)；AT:室內(nèi)溫度；HT:高溫(40±1 ℃)。下同。

LT1:Low temperature(-7.5±2.5 ℃); LT2:Low temperature 2(7.5±2.5 ℃); AT:Ambient temperature; HT:High temperature(40±1 ℃). The same in other tables.

2.3 α-淀粉酶基因相對表達量(2-△△Ct )隨種子貯藏溫度和時間的變化

以貯藏在LT1條件下種子的相對表達量為對照。在第1貯藏階段，貯藏在LT2和AT條件下的種子發(fā)芽期 amy1基因的表達量只達到對照的43.8%和16.7%，極顯著降低；在第2貯藏階段(189 d)，分別相當于對照的148.9%和299.0%，極顯著地升高；但在第3階段(252 d)，又分別相當于對照的60.9%和110.4%，表現(xiàn)為極顯著下降或不明顯升高；在第4階段(365 d)，相當于對照的131.2%和95.8%，上升或下降幅度差異不明顯。因此，與貯藏在LT1條件下的種子相比，貯藏在LT2和AT條件下種子的 amy1基因表現(xiàn)為貯藏開始時極顯著下調表達、貯藏中期極顯著上調表達、貯藏后期不明顯上調或下調表達。但是， amy3基因的相對表達量，在4個貯藏階段均表現(xiàn)為不明顯地下降，相當于對照的53.5%～88.2%。由圖2可知，若以第1貯藏階段種子的相對表達量為對照，則貯藏在低溫(LT1和LT2)下的種子，其發(fā)芽期 amy1基因的相對表達量隨貯藏時間的延長而呈極顯著下調表達，分別相當于對照的15.0%～26.2%和41.2%～70.5%。但是，在室溫及高溫貯藏條件下，隨貯藏時間的增加表現(xiàn)為開始時極顯著上調表達，然后再顯著或不顯著地下調表達，分別相當于對照的96.1%～372.8%和93%～238%。由圖3可知，與 amy1基因的表達行為相反，在室溫及低溫(LT1和LT2)下貯藏的種子，其發(fā)芽期 amy3基因的相對表達量隨貯藏時間的推移先呈不顯著或極顯著上調表達，然后再顯著或不顯著地下降，分別相當于各自對照(第1貯藏階段的種子的相對表達量)的1.11%～104.2%、72.9%～190.6%和1.5%～161.7%。在HT條件下，則表現(xiàn)為不顯著或顯著下調表達，相當于對照表達量的53%～81%。

LT1:低溫1(-7.5±2.5 ℃)；LT2:低溫2(7.5±2.5 ℃)；AT:室內(nèi)溫度；HT:高溫(40 ℃±1 ℃)。橫坐標上的數(shù)字為儲藏天數(shù)。在同一貯藏溫度內(nèi)，圖注上不同字母表示在0.05水平上有顯著差異。

LT1:Low temperature 1(-7.5±2.5 ℃)；LT2:Low temperature 2(7.5±2.5 ℃)；AT:Ambient temperature in Kunming；HT:High temperature(40 ℃±1 ℃). The digital on x-axis is days of seed stored. The different letters on the chart indicate significant differences at 0.05 levels in the same storage temperature.

圖1臨滄鐵殼麥種子發(fā)芽期α-淀粉酶活性隨貯藏種子的溫度和時間的變化

Fig.1Changesofα-amylaseactivityatgerminationstageinLincanghulledwheatseedswiththeincreaseofstoragetemperatureandtime

LT1:低溫1(-7.5±2.5 ℃)；LT2:低溫2(7.5±2.5 ℃)；AT:室內(nèi)溫度；HT:高溫(40 ℃±1 ℃)。橫坐標上的數(shù)字為儲藏天數(shù)。*和**表示在同一貯藏溫度內(nèi)不同貯藏期種子的 amy1基因相對表達量與對照(數(shù)值為1.000)間的差異分別達到0.05和0.01的顯著水平。圖3同。

LT1:Low temperature 1(-7.5±2.5 ℃)；LT2:Low temperature 2(7.5±2.5 ℃)；AT:Ambient temperature in Kunming；HT:High temperature(40 ℃±1 ℃). The digital on x-axis is days of seed stored. * and ** showed that differences between relative expression quantitation(REQ) of amy1 gene during storage marked within same temperature and REQ of control(1.000) are significant at 0.05 and 0.01 levels, respectively.The same in figure 3.

圖2amy1基因的相對表達量隨貯藏種子的溫度和時間的變化

Fig.2Changesofrelativeexpressionquantitationofamy1withtheincreaseofseedstoragetemperatureandtime

圖3 amy3基因的相對表達量隨貯藏種子的溫度和時間的變化

與在LT1和LT2溫度下貯藏189 d種子的相對表達量相比，貯藏在高溫條件種子的 amy1基因表現(xiàn)為不顯著、顯著或極顯著地上調表達，相當于對照的107.5%～274.1%和72.2%～184.1%。但與在AT條件下貯藏189 d的種子相比，則呈極顯著、顯著或不顯著地下調表達，為對照的36.0%～91.7%。同樣，與在LT1、LT2和AT溫度下貯藏189 d的種子相比，貯藏在HT溫度下的種子，其 amy3基因表現(xiàn)為不顯著、顯著或極顯著下調表達，為對照的44.4%～84.6%、50.4%～96%和53.6%～102.1%。

2.4 a-淀粉酶活性及基因相對表達量(2-△Ct )與種子貯藏時間及生活力指標間的相關性

由表3可知，隨著種子貯藏溫度的提高，有顯著相關性的觀測性狀或指標的數(shù)目也隨之增多，但生活力指標間的顯著相關性始終都是主要的。α-淀粉酶活性及基因相對表達量與種子的貯藏時間、生活力間的顯著或極顯著相關性，在不同的貯藏溫度間表現(xiàn)不同。在低溫條件下，無論是貯藏時間還是α-淀粉酶活性及其基因相對表達量與生活力指標間均無明顯相關性，僅α-淀粉酶活性與 amy3基因的相對表達量間存在極顯著(r=-0.769)或顯著(r=-0.670)負相關，以及貯藏時間與 amy1(r= -0.823和r= -0.646)、 amy3(r=-0.889)基因的相對表達量間存在顯著或極顯著負相關。在室溫和高溫條件下，貯藏時間、α-淀粉酶活性及其基因相對表達量不僅與生活力指標間有顯著相關關系，而且α-淀粉酶活性同其基因相對表達量間的相關性也發(fā)生了改變，由低溫條件下與 amy3基因相對表達量呈極顯著或顯著負相關轉變?yōu)榕c amy3基因相對表達量呈極顯著(r=0.570)正相關、與 amy1基因相對表達量呈顯著(r=-0.543)或極顯著(r=-0.568)負相關；另外，貯藏時間與生活力指標(r=-0.487～-0.559)、 amy3基因的相對表達量(r=-0.770和-0.436)及α-淀粉酶活性(r=-0.729)呈顯著和極顯著負相關。

另外，在室溫條件下，僅發(fā)芽率與 amy3基因相對表達量(r= 0.543)呈顯著相關性。而高溫條件下，除發(fā)芽率與α-淀粉酶活性和 amy3基因相對表達量呈顯著或極顯著正相關外，其他4項生活力指標也均與這2個觀測指標呈顯著或極顯著正相關。值得注意的是，無論在室溫還是高溫條件下，生活力指標都只與 amy3基因而不是 amy1基因的相對表達量有顯著相關性。

表3 不同貯藏溫度下相關系數(shù)達到顯著或極顯著水平的指標Table 3 Correlation coefficients reaching the significant level among observationindices of seeds stored at different storage temperature

括號內(nèi)的數(shù)字為相關系數(shù)；*和**分別表示達到0.05和0.01的顯著水平。

The number in brackets are correlation coefficients; * and ** mean significant at 0.05 and 0.01 levels, respectively.

3 討 論

在昆明的氣候條件下，密封貯藏在室溫及低溫(-7.5±2.5 ℃和7.5 ℃±2.5 ℃)種質庫的臨滄鐵殼麥種子，發(fā)芽期α-淀粉酶活性有隨種子貯藏溫度升高和貯藏時間延長而逐步升高的趨勢，與其他小麥種子隨萌發(fā)時間的延長而升高[12,21]的結果一致。而貯藏在高溫(40±1 ℃)條件下的種子，發(fā)芽期α-淀粉酶活性雖然隨貯藏時間的延長顯著下降，并在貯藏至42 d后趨于穩(wěn)定，但仍明顯地高于貯藏在低溫條件下的種子，高1.242～13.080 mg·g-1。因此，高溫貯藏處理明顯提升了臨滄鐵殼麥種子發(fā)芽期的α-淀粉酶活性，與朱美榮[22]利用晝35 ℃和夜27 ℃處理小麥種子7 d獲得的結果相似。

近年來的研究表明，α-淀粉酶基因的表達與轉錄，除受到脫落酸(ABA)、赤霉素(GA)、油菜素內(nèi)酯(BR)和乙烯(ETH)等多種內(nèi)源激素及ABA/GAs的調控[23-25]外，也明顯與種子萌發(fā)過程中的溫度有關[12]。本研究中，貯藏在高溫條件下種子的 amy1基因表達量明顯高于貯藏在低溫(LT1和LT2)條件下189 d的種子，為LT1下的107.5%～274.1%和LT2下的72.2%～184.1%；而同樣貯藏在高溫條件下的種子，其 amy3基因表達量則僅分別相當于在LT1、LT2和AT溫度條件下貯藏189 d種子的44.4%～84.6%、50.4%～96%和53.6%～102.1%。因此，溫度對 amy1和 amy3基因表達量的影響可能是不同的。高溫顯著提高 amy1基因的表達量，而顯著地降低 amy3基因的表達量。說明相同的種子貯藏溫度能明顯影響種子萌發(fā)過程中不同的α-淀粉酶基因的表達。但是，由于未篩選到用于研究 amy2基因相對表達量的PCR引物，因此，有關臨滄鐵殼麥或云南小麥亞種 amy2基因的相對表達量隨種子貯藏溫度、貯藏時間的變化，以及與生活力指標之間的相關性，有待進一步研究。

貯藏在低溫條件下種子的α-淀粉酶活性與 amy3基因的相對表達量呈極顯著、顯著負相關，而貯藏在高溫條件下種子的α-淀粉酶活性又與 amy3基因相對表達量呈極顯著正相關的關系，說明 amy3基因在高溫和低溫條件下的表達機制可能不同。另外，周 飛[18]設計的5對引物擴增小麥品種川農(nóng)24和川農(nóng)27的cDNA，只有第1對引物(AMY-1)獲得了1條約1 300 bp的清晰條帶，未獲得引物AMY-2的擴增條帶，而在本研究選用的小麥臨滄鐵殼麥中，僅引物AMY-2(而非AMY-1)獲得了清晰條帶，并且其擴增曲線和熔解曲線與內(nèi)參基因擴增引物獲得的結果一致。所以，臨滄鐵殼麥種子發(fā)芽期的 amy3基因可能與川農(nóng)24和川農(nóng)27的有一定差異。

本研究中貯藏在低溫條件下種子的生活力指標與貯藏時間、α-淀粉酶活性及其基因相對表達之間無明顯相關性，而貯藏在高溫條件種子的生活力指標均與貯藏時間、α-淀粉酶活性及其 amy3基因的相對表達量呈顯著或極顯著相關性，表明隨著貯藏溫度逐漸升高，種子生活力與貯藏時間、α-淀粉酶活性及其基因相對表達量間的關系也由不顯著變?yōu)轱@著或極顯著，由不緊密變?yōu)榉浅＞o密，即高溫提升種子生活力與貯藏時間、α-淀粉酶活性及基因表達量間的相關性。

參考文獻：

[1]YANG J,LIU Y,PU Z,etal.Molecular characterization of high pia-amylase and its expression QTL analysis in synthetic wheat RILs [J].MolecularBreeding,2014,34(3):1075.

[2] KONDHARE K R,FARRELL A D,KETTLEWELL P S,etal.Pre-maturity α-amylase in wheat:The role of abscisic acid and gibberellins [J].JournalofCerealScience,2015,63:95.

[3]KONDHARE K R,KETTLEWELL P S,FARRELL A D,etal.Effects of exogenous abscisic acid and gibberellic acid on pre-maturity α-amylase formation in wheat grains [J].Euphytica,2012(188):51.

[4]LUNN G D,MAJOR B J,KETTLEWELL P S,etal.Mechanisms leading to excess α-amylase activity in wheat(TriticumaestivumL.) grain in the UK [J].JournalofCerealScience,2001(33):314.

[5]BARRERO J M,MRVA K,TALBOT M J,etal.Genetic,hormonal,and physiological analysis of late maturity α-amylase in wheat [J].PlantPhysiology,2013(161):1265.

[6]RAL J P,WHAN A,LARROQUE O,etal.Engineering high α-amylase levels in wheat grain lowers falling number but improves baking properties [J].PlantBiotechnologyJournal,2016,14(1):364.

[7]CHENG C,OLDACH K,MRVA K,etal.Analysis of high pI α-A-amy-1 gene family members expressed in late maturity a-amylase in wheat(TriticumaestivumL.) [J].MolecularBreeding,2014,33(3):519.

[8]DE LAETHAUWER S,DE RIEK J,STALS I,etal.α-amylase gene expression during kernel development in relation to pre-harvest sprouting in wheat and triticale [J].ActaPhysiologiaePlantarum,2013,35(10):2928.

[9] 肖世和,陳 孝,徐慧君,等.大麥α-淀粉酶抑制基因對小麥α-淀粉酶的抑制作用研究 [J].作物學報,1998,24(6):763.

XIAO S H,CHEN X,XU H J,etal.Studies on effect of α-amylase inhibitor gene from barley on the a-amylase activity in wheat [J].ActaAgronomicaSinica,1998,24(6):763.

[10] 朱美榮,張如標,王蓓蓓,等.小麥穗發(fā)芽生理及調控途徑研究進展 [J].金陵科技學院學報,2010,26(2):50.

ZHU M R,ZHANG R B,WANG B B,etal.Wheat pre-harvest sprouting physiology and control approaches [J].JournalofJinlingInstituteofTechnology,2010,26(2):50.

[11]DELAETHAUWER S,DERIEK J,STALS I,etal.α-amylase gene expression during kernel development in relation to pre-harvest sprouting in wheat and triticale [J].ActaPhysiologiaePlantarum,2013,35(10):2928.

[12] 劉 美,張 鳳,楊翠翠,等.小麥種子萌發(fā)早期淀粉降解關鍵酶活性及基因表達量研究 [J].山東農(nóng)業(yè)科學,2014(9):39.

LIU M,ZHANG F,YANG C C,etal.Study on key starch degrading enzyme activity and related gene expression level during early germination stage of wheat seed [J].ShandongAgriculturalSciences,2014(9):39.

[13] 張海峰,盧榮禾.小麥穗發(fā)芽抗性機理與遺傳研究 [J].作物學報,1993,19(6):528.

ZHANG H F,LU R H.Study on the mechanism of the resistance to pre-harvest sprouting and inheritance inwheat [J].ActaAgronomicaSinica,1993,19(6):528.

[14] 晏本菊.中國西南麥區(qū)普通小麥(TriticumaestivumL.)優(yōu)質育種的生化遺傳基礎研究[D].雅安:四川農(nóng)業(yè)大學,2004:56.

YAN B J.Study on biochemical and genetic basis of quality breeding in common wheat(TriticumaestivumL.) in Southwest China [D].Ya’an:Sichuan Agricultural University,2004:56

[15] 楊金華,于亞雄,程加省,等.云南鐵殼麥穗發(fā)芽抗性及成因初步研究 [J].麥類作物學報,2011,31(4):747.

YANG J H,YU Y X,CHENG J S,etal.Study on the pre-harvest sprouting tolerance inTriticumaestivumssp.Yunnanenseking [J].JournalofTriticeaeCrops,2011,31(4):747.

[16]BARRERO J M,CAVANAGH C,VERBYLA K L,etal.Transcriptomic analysis of wheat near-isogenic lines identifies PM19-A1 and A2 as candidates for a major dormancy QTL [J].GenomeBiology,2015,16(1):14.

[17]ZHANG Y,MIAO X,XIA X,etal.Cloning of seed dormancy genes(TaSdr) associated with tolerance to pre-harvest sprouting in common wheat and development of a functional marker [J].TheoreticalandAppliedGenetics,2014,127(4):857.

[18] 周 飛.小麥種子發(fā)芽率的生化遺傳機制的初步研究[D].雅安:四川農(nóng)業(yè)大學,2011:21.

ZHOU F.The genetic and biochemical mechanism on seed germination of wheat [D].Ya’an:Sichuan Agricultural University,2011:21.

[19]NIU JS,ZHANG LN,HONG DF,etal.Cloning ,characterization and expression of wheat EDR1(enhanced disease resistance) gene [J].JournalofPlantPhysiologyandMolecularBiology,2005,31(5):478.

[20]LI C Y,ZHANG R Q,FU K Y,etal.Effects of high temperature on starch morphology and the expression of genes related to starch biosynthesis and degradation [J].JournalofCerealScience,2017,73:27.

[21] 萬中原,王志欣,楊文思,等.溫度和PEG處理對小麥種子萌發(fā)期間酶學特性的影響 [J].山東農(nóng)業(yè)科學,2013,45(7):42.

WAN Z Y,WANG Z X,YANG W S,etal.Influences of temperature and peg treatment on enzymatic characteristics during wheat seed germination [J].ShandongAgriculturalSciences,2013,45(7):42.

[22] 朱美榮.貯藏時間和溫度對小麥穗粒發(fā)芽率與α-淀粉酶活性的影響[D].揚州:揚州大學,2011:1.

ZHU M R.Effects of storage duration and temperature on spike germination,seed germination and the activity of a-amylase [D].Yangzhou:Yangzhou University,2011:1.

[23] 李振華,王建華.種子活力與萌發(fā)的生理與分子機制研究進展 [J].中國農(nóng)業(yè)科學,2015(4):648.

LI Z H,WANG J H.Advances in research of physiological and molecular mechanism in seed vigor and germination [J].ScientiaAgriculturaSinica,2015(4):648.

[24] 賴曉輝,李 群.種子休眠與萌發(fā)分子機制研究進展 [J].種子,2014(5):54.

LAI X H,LI Q.Molecular mechanisms of seed dormancy and germination progress [J].Seed,2014(5):54.

[25] 劉春華,王 鵬,夏 超,等.種子休眠與萌發(fā)相關激素突變體研究進展 [J].作物雜志,2014(3):139.

LIU C H,WANG P,XIA C,etal.Overview of hormone mutants related on seed dormancy and germination [J].Crops,2014(3):139.