小麥QTL富集區 QC-4BS重要農藝性狀基因的精細定位及 Rht1基因的效應分析

丁夢云，劉天相，孫宇慧，柴乖強，高 欣，王 軍，王中華，李春蓮

(西北農林科技大學農學院/旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100)

小麥是世界上最重要的糧食作物之一，培育高產、優質、多抗、廣適的小麥品種是小麥育種工作的總體目標。小麥的大部分農藝性狀，如產量性狀、品質性狀、適應性狀及株型性狀等為多基因控制的數量性狀，受環境影響較大。近年來，隨著分子標記技術的快速發展和數量性狀位點(quantitative trait locus， QTL)定位方法的不斷改進，使得利用分子標記技術和QTL分析方法定位數量性狀基因、篩選與性狀緊密連鎖的分子標記用于輔助育種成為可能。越來越多的控制小麥重要農藝性狀的QTL被發現和定位，同時一些與QTL緊密連鎖的分子標記不斷地被開發應用于分子標記輔助選擇育種[1-3]，從而大大地加快了育種進程，提高了育種效率。研究表明，在大多數作物中，與農藝性狀相關的QTL在染色體上往往成簇分布，即控制不同性狀的QTL存在于同一染色體的某一區段，從而形成QTL富集區[4-6]。QTL富集區的形成原因主要有兩種：一是控制多個性狀的幾個基因彼此緊密連鎖形成基因簇；二是單一基因直接或間接影響多個性狀，即一因多效現象[7-9]。

在前期研究中，本課題組在1BS、2DS、4BS、5AL、6AL和7AL等染色體上發現了多個與小麥重要農藝性狀相關的QTL富集區，其中位于4BS的Xwmc48至IWA4662標記區間是小麥重要農藝性狀的一個主要的QTL富集區，區間長度為14.7 cM，將其定名為 QC-4BS。與穗粒數(KNPS)、千粒重(TKW)、株高(PH)、蛋白質含量(GPC)、容重(TW)、單粒重和粒寬相關的7個主效QTL位于 QC-4BS區間，解釋的表型變異分別可達14.5%、14.4%、36.0%、22.0%、29.5%、27.6%和13.4%，其中與PH、KNPS、GPC及TW相關的QTL在多個環境中均可檢測到，且已確定控制株高的QTL為 Rht1基因[10-12]。因此探明 QC-4BS染色體功能區段的遺傳效應，挖掘其功能基因，揭示其傳遞機制及基因間的互作效應對于小麥產量及品質性狀的選育及遺傳改良具有重要的意義。本研究擬通過對 QC-4BS的精細定位，及分析 Rht1基因對小麥PH、KNPS、GPC及TW等性狀的遺傳效應，篩選與這些性狀緊密連鎖的分子標記，為小麥優良基因的挖掘及小麥染色體功能區段形成機制的研究奠定基礎，同時為小麥分子標記輔助選擇育種及多性狀聚合育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為普通小麥(TriticumaestivumL.)寧7840與Clark雜交獲得的127個F12代重組自交系(Recombinant inbred line，RIL),由美國堪薩斯州立大學Guihua Bai教授惠贈。寧7840為江蘇省農業科學院育成的硬紅粒小麥品種，每穗粒數30～35粒，千粒重35 g左右，株高偏高，對小麥銹病、白粉病及赤霉病均具有抗性，是多抗性育種的重要基礎材料[13]；Clark為美國普渡大學育成的軟粒冬小麥品種，長穗、大粒，具有較好的產量潛力[14]。親本及RIL株系的PH、KNPS、GPC及TW性狀鑒定方法及表型值參見Li等[10-12]研究。

1.2 遺傳連鎖圖譜的構建

采用9K InfiniumTMiSelect SNP基因芯片及親本間有差異的SSR標記對RIL群體進行分析，共獲得了2 404個SNP標記和366個SSR標記。采用QTL IciMapping 4.0軟件構建遺傳連鎖圖譜，連鎖群的LOD閾值設為6.0，利用Kosambi作圖函數將重組率轉換為遺傳距離(cM)，根據SSR 共識圖譜[15]及GrainGenes 2.0網站上公布的小麥SNP遺傳圖譜進行連鎖群染色體定位。

1.3 QTL分析

基于完備復合區間作圖法(ICIM-ADD)，采用QTL IciMapping 4.0軟件對PH、KNPS、GPC及TW等性狀進行QTL分析。在掃描步長為1.0 cM，α=0.001的水平上，利用置換檢驗法(Permutation test)做1 000 次重復，將第一類錯誤概率(假陽性)限制在5%，估算基因組范圍內的LOD閾值，并以此確定QTL在染色體上的位置及數目。

2 結果與分析

2.1 QC-4BS區間的QTL分析

構建的遺傳連鎖圖譜中共有2 709個標記，包括2 403個SNP標記和306個SSR標記定位到了45個連鎖群中，覆蓋了小麥21個遺傳連鎖群。圖譜總遺傳長度為3 885.1 cM，標記密度為1.43 cM。利用該圖譜對PH、KNPS、GPC及TW進行了QTL分析，其中 QC-4BS位于小麥4BS染色體的Xwmc48至IWA4662標記區間(圖1)。 QC-4BS中控制PH的QTL位于IWA1846至IWA4662標記區間，區間長度為11.9 cM，LOD峰值接近IWA482，解釋的表型變異為15.5%～31.4%；控制KNPS的QTL主要位于 QC-4BS的Xwmc48至IWA482標記區間，區間長度為8.7 cM，LOD峰值接近IWA6850，解釋的表型變異為10.4%～15.4%；控制GPC的QTL位于 QC-4BS的Xgwm368至IWA4662標記區間，區間長度為17.5 cM，LOD峰值接近IWA6850，解釋的表型變異為7.5%～18.6%；控制TW的QTL位于 QC-4BS的IWA482至IWA4662標記區間，區間長度為11.0 cM，LOD峰值接近IWA482，解釋的表型變異為6.7%～20.4%(表1)。

圖1 QC-4BS富集區的QTL

2.2 QC-4BS富集區基因位點的精細定位

由QTL分析結果及其峰值所在位置可知， QC-4BS基本位于SNP標記IWA1846至IWA4662區間內，將該標記區間(長度為11.9 cM)對應在660K遺傳圖譜中(未發表)，并利用已公布的小麥基因組數據(IWGSC Reference Sequence v1.0，https：//wheat-urgi.versailles.inra.fr)對該區間的基因進行了精細定位。結果(圖2)表明，該區間對應的物理距離約為15.17 Mb， Rht1基因(控制PH的QTL位點)距離IWA1846約7.16 Mb；GPC和KNPS位點接近IWA482標記；TW位點接近 Rht1基因。

2.3 Rht1基因對小麥重要農藝性狀的效應

Rht1基因對PH、KNPS、TKW、GPC及TW等性狀的效應分析結果(表2)表明，該基因具有降低PH的效應，在檢測的3個環境中， Rht1降低PH的效應均達到了極顯著水平，其效應值為9.0%～9.8%； Rht1對產量因子KNPS和TKW的效應相反， Rht1顯著增加KNPS，其效應值為3.4%～10.7%，在檢測的3個環境中均達到了顯著或極顯著水平，而 Rht1對TKW為負效應，其降低TKW的效應在兩個環境具有顯著差異； Rht1對品質性狀GPC和TW均為顯著負效應，其效應值分別為3.3%～4.4%和0.8%～3.1%。

表1 QC-4BS富集區的QTL分析Table 1 QTL analysis of QC-4BS cluster

ST01、ST02、ST03、LA02、AL02中ST、LA和AL分別表示美國Oklahoma州的Stillwater(ST)、Lahoma(LA)和Altus(AL)，數字01、02和03代表不同年份。

The ST,LA and AL represent three Oklahoma locations,Stillwater(ST),Lahoma(LA) and Altus(AL) in USA,respectively; and 01,02,and 03 represent three different years,respectively.

圖2 QC-4BS富集區重要農藝性狀基因的精細定位

性狀Trait株高PH/cmST01ST02ST03穗粒數KNPSST01ST02ST03千粒重TKW/gST01ST02ST03蛋白質含量GPC/%ST01ST02ST03容重TW/(g·L-1)ST01ST02ST03表型值(Rht1+)Phenotypevalue(Rht1+)63.974.874.437.834.439.129.921.928.512.712.813.8537493527表型值(Rht1-)Phenotypevalue(Rht1-)69.682.181.136.631.136.031.024.330.213.113.314.4541509537效應Effect/%-8.2**-8.9**-8.3**3.4*10.7**8.5**-3.7-10.1**-5.5*-3.3**-3.9**-4.4**-0.8*-3.1**-1.8**

**：P<0.01；*：P<0.05.

3 討 論

本研究發現 QC-4BS位于小麥4BS染色體上的Xwmc48至IWA4662標記區間，在該區間前人也曾定位到了與小麥產量、株高、抽穗期、粒重、收獲指數、成穗數、穗粒數及成熟期等性狀相關的QTL[16-21]，表明 QC-4BS的確是一個小麥重要農藝性狀的QTL富集區。本研究根據小麥660K連鎖圖譜及小麥基因組數據對 QC-4BS區間的基因進行了精細定位，將 QC-4BS定位在WA1846至IWA4662標記區間，其對應的物理距離為15.17 Mb。已知 QC-4BS中控制株高的QTL為 Rht1基因[20]，距離IWA1846標記約7.16 Mb，根據GPC和KNPS的峰值位點標記 IWA6850/IWA1846及TW的峰值位點標記 IWA482，將控制KNPS、GPC及TW的位點定位在 Rht1附近。目前，在 QC-4BS富集區還未定名任何與產量及品質性狀相關的基因，而本研究在該區間定位的與KNPS、GPC及TW相關的QTL在多個環境中均被檢測到，且具有相對較大的遺傳效應，表明該區間存在與產量及品質性狀相關的基因。相關性分析結果表明，不同環境中的PH、 KNPS、GPC及TW之間均存在顯著相關性，具體表現為PH與KNPS為負相關，而與GPC和TW為正相關；KNPS與GPC和TW之間為負相關，而且IWA482、IWA1846、IWA6850、IWA4662等標記與這些性狀緊密連鎖，表明這些性狀之間可能存在一因多效或基因互作效應。進一步分析發現，在 QC-4BS中增加PH、GPC和TW的等位基因及減少KNPS的等位基因來自親本寧7840。單倍型分析顯示RIL群體中與寧7840基因型一致的株系平均PH、GPC及TW均顯著高于其他株系，而KNPS低于其他株系，即高株、高蛋白質含量、高容重及低穗粒數為連鎖性狀，因此在育種中宜根據育種目的進行 QC-4BS富集區優異基因的聚合及優良性狀的選擇。此外，IWA482、IWA1846、IWA6850、IWA4662等標記可以作為這些性狀的選擇標記。

本研究對 Rht1基因對小麥PH、KNPS、TKW、GPC及TW的效應進行了分析，結果顯示 Rht1基因具有降低株高的作用，其降稈效應為8.2%～8.9%，比其他研究中的 Rht1的降稈強度(20%～25%)相對較弱[22-25]，這可能是因為本研究采用的研究群體較為特殊，在該群體中還檢測到了另外一個矮稈基因 Rht12(QPh.hwwgr-5AL)及其他矮稈位點[22]，這些基因位點間的互作導致了該群體株高存在復雜的變異。前人研究表明，矮稈基因對小麥某些農藝性狀是有影響的，尤其是產量和品質性狀[25-26]。 Rht1及 Rht2為赤霉酸不敏感基因，研究表明這類矮稈基因在選育品種中分布較廣，除了降低株高，防倒伏外，還具有增加小穗結實率、降低粒重和蛋白質含量的效應[27-29]。Mccartney等[30]對春小麥農藝性狀QTL研究發現， Rht1位點往往與產量構成因子的QTL熱點區域重合。本研究中采用RIL家系同樣發現 Rht1具有顯著增加小麥穗粒數、降低蛋白質含量及千粒重的效應，這與前人的研究結果[25-28]是一致的。而且， Rht1基因與KNPS、GPC及TW位點緊密連鎖，這些研究結果進一步表明，在小麥育種選擇中注重株高選擇的同時要兼顧產量性狀及品質性狀的選擇。

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