寡核苷酸探針套涂染結(jié)合基因組原位雜交和分子標(biāo)記分析準(zhǔn)確鑒定小麥-百薩偃麥草異源易位系的研究

楊 驕，劉志濤，陳健泳，王艷芝，莊麗芳，亓增軍

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室，江蘇南京 210095)

染色體工程是小麥遺傳改良的重要途徑，在轉(zhuǎn)移和利用外源基因、培育持久抗性品種和拓寬小麥遺傳基礎(chǔ)研究中做出了重要貢獻[1]。近年來，采用多種染色體誘變技術(shù)，越來越多的小麥異源易位系不斷創(chuàng)造出來，不但為小麥品種改良提供了重要基因資源，而且為染色體生物學(xué)和基因組學(xué)研究提供了重要工具材料。染色體分帶、基因組原位雜交(Genomicinsituhybridization, GISH)和以質(zhì)粒為探針的熒光原位雜交(Fluorescenceinsituhybridization, FISH)[1-3]技術(shù)在外源染色體研究中發(fā)揮重要作用，但是，這些技術(shù)染色體專化性差，染色體識別清晰度低，探針制備和雜交程序復(fù)雜、成本高，因此尚不能大規(guī)模和準(zhǔn)確鑒定各類易位系，特別是小片段和非補償性易位系[4-5]，從而限制了這些新易位系的深入研究和應(yīng)用。

最新發(fā)展的寡核苷酸探針套涂染技術(shù)可以通過一次FISH準(zhǔn)確識別小麥及其親緣植物染色體，不但能揭示不同品種間染色體的多態(tài)性[4-5]，而且還可以不通過GISH分析直接識別我國小麥品種中常見的三種易位系，即T1BL·1RS，T6VS·6AL及相互易位T1RS·7DL和T7DS·1BL[5]，顯示了該技術(shù)的簡單、經(jīng)濟和高效特點。但是，單一的寡核苷酸探針套涂染仍難以準(zhǔn)確判斷發(fā)生在小麥和外源染色體常染色質(zhì)區(qū)或缺少明顯帶紋特征區(qū)段的易位斷點，仍然存在一定的局限性[4-5]。分子標(biāo)記在鑒定染色體易位片段、染色體部分同源性和物理作圖中發(fā)揮重要作用[6-13]，特別是在鑒定小片段易位時更有獨特的優(yōu)勢[10-13]。但是，單一的分子標(biāo)記分析難以鑒定相互易位等復(fù)雜變異，分子標(biāo)記分析揭示的易位片段必須結(jié)合細胞學(xué)分析才能得到確證，因此，綜合利用細胞遺傳和分子標(biāo)記分析，可以取長補短，提高染色體變異鑒定效率。為探討最新發(fā)展的寡核苷酸探針套涂染技術(shù)與GISH和分子標(biāo)記分析相結(jié)合在準(zhǔn)確鑒定各類染色體變異中的應(yīng)用潛力，本研究以通過電離輻射誘致的兩個小麥-百薩偃麥草5J染色體易位系為材料，探討綜合利用寡核苷酸探針套涂染、GISH和分子標(biāo)記分析準(zhǔn)確鑒定染色體易位片段及其他染色體變異，確定染色體易位斷點并進行染色體物理作圖，以期為準(zhǔn)確鑒定小麥異源易位系提供更有效的方法，并為更好地研究和利用這些易位系、揭示外源染色體的共線性特點提供信息。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料包括中國春(2n=6x=42)、中國春-百薩偃麥草雙倍體(2n=8x=56)、百薩偃麥草(2n=2x=14)、中國春-百薩偃麥草二體異代換系DS5J(5A)及DS5J(5A)經(jīng)配子電離輻射并與中國春回交獲得的穩(wěn)定的小麥-百薩偃麥草易位系NAU16YJ127和NAU16YJ124(兩個易位系的具體易位片段尚未得到準(zhǔn)確鑒定)[14-15]。

1.2 方 法

1.2.1 細胞遺傳分析

根尖細胞有絲分裂中期染色體制片：參考Kato[16]的方法并加以改動。將種子置于23 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h左右，在種子露白后倒掉多余水分，繼續(xù)培養(yǎng)到根長約1～2 cm時，剪取根尖放于一氧化二氮(N2O)中處理2 h，然后將處理過的根尖用90%冰醋酸固定10 min后，取出，置于70%乙醇中保存。制片時，取出根尖，吸去乙醇后置于45.0%醋酸中解離3～5 min，然后，切取分生組織壓片。染色體制片在-70 ℃冰箱中過夜，然后，揭去蓋玻片，在無水乙醇中脫水后備用。

原位雜交所用探針及其標(biāo)記方法：百薩偃麥草基因組DNA探針采用缺口平移法，利用Fluorescein-12-dUTP進行標(biāo)記，具體參照Du等的方法[4]。所用寡核苷酸探針套包括(GAA)10、pSc119.2-1、pAs1-1、pAs1-3、AfA-3和AfA-4 六個寡核苷酸探針，其序列組成和修飾參照Du等[4]和王丹蕊等[5]的方法，其中(GAA)10、pSc119.2-1為FAM修飾，pAs1-1、pAs1-3、AfA-3和AfA-4為TAMRA修飾。

雜交液組成：每張染色體制片所用的雜交液總體積為22 μL，包含99.5%的甲酰胺(Sigma公司)7.5 μL，20 × SSC 1.5 μL，10 mg·mL-1的Salmon sperm DNA 0.5 μL，50.0%的Dextran Sulfate 2.5 μL，Blocking DNA(2 000 ng·L-1) 2 μL，百薩偃麥草基因組DNA探針2 μL，1 pmol·μL-1的(GAA)10，10 pmol·μL-1的pSc119.2-1、pAs1-1、pAs1-3、AfA-3和AfA-4各1 μL。

雜交程序和顯微鏡觀察：雜交液于105 ℃變性13 min，隨后迅速將含有雜交液的離心管置于-20 ℃酒精中冷卻10 min以上，然后將雜交液加到已經(jīng)變性的染色體制片上，在37 ℃恒溫箱中雜交6 h以上，揭去蓋玻片，在42 ℃蒸餾水中洗2次(各5 min)，于常溫下在McIIvaine buffer(3.6 g C6H8O7和58.9 g Na2HPO4用ddH2O定容至1 000 mL)中洗5 min，用洗耳球迅速吹干后，用含DAPI的Mounting膠(Vectashield H-1200，Vector公司)在黑暗中套染10 min，蓋上蓋片，在Olympus BX51型熒光顯微鏡下觀察，用SPOT CCD(SPOT Cooled Color Digital Camera)獲取圖像。

1.2.2 分子標(biāo)記分析

植物基因組DNA提取采用CTAB法，具體步驟參考文獻[14]，本研究選用21個百薩偃麥草染色體5J特異分子標(biāo)記[14-15]，其標(biāo)記名稱、引物序列、染色體定位和來源見表1。

PCR擴增體系為10 μL，包含2×Tsingke Master Mix(即用型快速PCR反應(yīng)緩沖液，擎科公司) 5 μL，模板DNA 1.5 μL，引物0.5 μL，ddH2O 3 μL。PCR反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，52～55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min 10 s，34～36個循環(huán)；72 ℃退火10 min；置于4 ℃保存。

對擴增產(chǎn)物進行8.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后使用“兩步法”對擴增產(chǎn)物進行銀染檢測，然后進行觀察拍照，利用凝膠成像分析儀(JS-680D，上海培清科技有限公司)提供的圖像分析軟件Launch SensiAnsys對目標(biāo)條帶分子量進行測定。

1.2.3 物理作圖分析

根據(jù)21個標(biāo)記在中國春、中國春-百薩偃麥草雙倍體、DS5J(5A)及NAU16-YJ127和NAU16YJ124兩個易位系中的擴增結(jié)果，分別統(tǒng)計5J和5A特異標(biāo)記的擴增情況，具有預(yù)期擴增位點的記為“1”，沒有預(yù)期位點的記為“0”，實驗重復(fù)兩次，綜合標(biāo)記在5J、5A、T5JS·5JL-5AL#1和T5JS·5JL-6AL的擴增情況、染色體區(qū)段大小和區(qū)段重疊特點，結(jié)合劉志濤[14]前期的定位信息對21個5J特異標(biāo)記和3個5A特異標(biāo)記進行染色體區(qū)段定位，并繪制相應(yīng)的染色體物理圖譜，物理圖中每個區(qū)段包含的標(biāo)記為隨機排列，不代表遺傳順序，模式圖中區(qū)段大小參考易位區(qū)段在染色體上的實際比例繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 寡核苷酸探針套涂染和GISH分析結(jié)果

利用Du等[4]開發(fā)和王丹蕊等[5]優(yōu)化的寡核苷酸探針套結(jié)合GISH分析，對2個易位系(NAU16YJ127和NAU16YJ124)的染色體組成進行了鑒定。結(jié)果表明，易位系NAU16YJ127(2n=6x=42)包含一對易位染色體，其中外源片段包含完整的短臂和長臂大片段，而小麥染色體僅涉及頂端小片段且沒有任何B和D基因組染色體的特異雜交信號，同時整個核型中未發(fā)現(xiàn)完整的5A染色體，因此推測該易位發(fā)生在5J和5A之間，初步命名為T5JS·5JL-5AL#1，除了該易位染色體外，其6A和2D染色體長臂頂端發(fā)生相互易位，初步命名為T6AS·6AL-2DL和T2DS·2DL-6AL，其他染色體未見明顯變化(圖1)。易位系NAU16YJ124包含44條染色體，添加了一對小麥-百薩偃麥草易位染色體，其外源區(qū)段包含完整短臂但長臂區(qū)段明顯小于NAU16YJ127中T5JS·5JL-5AL#1的長臂區(qū)段，同時6A長臂發(fā)生缺失，僅包含近著絲粒綠色信號，命名為del6AL，而含有近端部綠色信號的6AL缺失區(qū)段易位到5JL上，形成T5JS·5JL-6AL(圖2)，其他小麥染色體未見明顯變化。

2.2 分子標(biāo)記分析結(jié)果

利用21個5J染色體特異分子標(biāo)記(包括2個短臂和19個長臂標(biāo)記)對供試材料進行分析，發(fā)現(xiàn)這些標(biāo)記均可以在中國春-百薩偃麥草雙倍體和DS5J(5A)擴增出特異位點(表1)，說明標(biāo)記穩(wěn)定可靠；進一步分析發(fā)現(xiàn)，兩個易位系均包含2個5J短臂標(biāo)記，但19個5J長臂標(biāo)記中，NAU16YJ127僅包含12個，其余7個定位于5JL缺失區(qū)段，而NAU16YJ124僅包含2個，其余17個定位于缺失區(qū)段，上述結(jié)果表明兩個易位系易位斷點明顯不同，與細胞學(xué)結(jié)果一致(表2、圖3)。

表1 用于本研究的21個百薩偃麥草5J染色體特異標(biāo)記Table 1 Twenty one markers specific for chromosome 5J of Th. bessarabicumused in this study

“a”表示來自王艷芝[15]；“b”表示來自劉志濤[14]；“c”表示引物序列來自https://wheat.pw.usda.gov/cgi-bin/GG3/browse.cgi?class=marker。

“a” indicates markers from Wang Yanzhi[15]; “b” indicates from Liu Zhitao[14]; “ c” indicates primer sequences from https://wheat.pw.usda.gov/cgi-bin/GG3/browse.cgi?class=marker.

a:藍色為DAPI套染；b:綠色為百薩偃麥草基因組DNA探針、寡核苷酸探針(GAA)10和pSc119.2-1信號；c：紅色為寡核苷酸探針pAs1-1、pAs1-3、AfA-3和AfA-4信號；d：a、b和c的合成圖，箭頭示變異染色體；A、B和D分別為小麥的三個基因組。

a:Blue indicates chromosomes counterstained with DAPI; b:Green shows signals from(GAA)10, pSc119.2-1 and genomic DNA ofTh.bessarabicumL labeled with Fluorescein-12-dUTP; c:Red shows signals from pAs1-1, pAs1-3, AfA-3 and AfA-4; d:Merged of a, b and c.Arrows indicate chromosome aberrations.A, B and D indicate the three genomes of wheat, respectively.

圖1普通小麥-百薩偃麥草易位系NAU16YJ127的寡核苷酸探針套涂染和GISH分析

Fig.1ChromosomepaintingusingoligonucleotidemultiplexandGISHanalysisinNAU16YJ127

根據(jù)21個標(biāo)記在DS5J(5A)中的擴增結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其中3個為共顯性標(biāo)記(圖3、圖4)，可以同時檢測染色體5A和5J。其中，NAU16Y124包含全部3個5A特異標(biāo)記，表明其含有完整的5A染色體，而NAU16YJ127僅包含2個5A特異標(biāo)記(X1EST281-5A和X5EST203-5A)，缺少5A特異標(biāo)記XZ2206-5A，由于NAU16YJ127含有的易位染色體T5JS·5JL-5AL#1僅含有5AL頂端小片段，因此X1EST281-5A和X5EST203-5A兩個標(biāo)記定位于5AL頂端區(qū)段，而XZ2206-5A在NAU127中沒有特異位點，因此定位于易位掉的5A區(qū)段，進一步證明了NAU16YJ127中的易位涉及5J和5A染色體(圖3、圖4)，驗證了細胞學(xué)結(jié)果。

a:藍色為DAPI染色；b:綠色為百薩偃麥草基因組DNA探針、寡核苷酸探針(GAA)10和pSc119.2-1信號；c：紅色為寡核苷酸探針pAs1-1、pAs1-3、AfA-3和AfA-4信號；d: a、b和c的合成圖，箭頭示變異染色體；A、B和D分別為小麥的三個基因組。

a:Blue indicates chromosomes counterstained with DAPI; b:Green shows signals from(GAA)10，pSc119.2-1 and genomic DNA ofTh.bessarabicumL labeled with Fluorescein-12-dUTP; c:Red shows signals from pAs1-1, pAs1-3, AfA-3 and AfA-4; d:Merged of a, b and c.Arrows indicate chromosome aberrations;A, B and D indicate the three genomes of wheat, respectively.

圖2普通小麥-百薩偃麥草易位系NAU16YJ124的寡核苷酸探針套涂染和GISH分析

Fig.2ChromosomepaintingusingoligonucleotidemultiplexandGISHanalysisinNAU16YJ124

2.3 物理作圖

根據(jù)21個5J特異標(biāo)記在完整5J和兩條易位染色體上的擴增結(jié)果，將21個標(biāo)記定位于5J染色體4個不同區(qū)段，其中短臂區(qū)段1個，包含2個標(biāo)記，長臂區(qū)段3個，命名為5JL-1～3，分別包含2、10和7個標(biāo)記(圖4)?？梢宰粉?A的3個特異標(biāo)記定位于5A的2個區(qū)段，其中2個位于5AL頂端，1個位于5A長臂近著絲粒區(qū)段(圖4)。

3 討 論

如何快速準(zhǔn)確地鑒定染色體變異一直是染色體工程的重要研究內(nèi)容。本研究結(jié)果表明，綜合分子標(biāo)記、寡核苷酸探針套涂染和GISH技術(shù)為實現(xiàn)這一目標(biāo)提供了新的方案。GISH技術(shù)可以準(zhǔn)確判斷易位片段大小，但無法明確身份和斷點位置，分子標(biāo)記可以快速識別大多數(shù)丟失的小麥和外源染色體或區(qū)段，但是不能直觀鑒定易位片段大小，對相互易位和倒位鑒定難度大甚至無法鑒定，寡核苷酸探針套涂染技術(shù)可以高清晰識別小麥染色體變異[4-5]，但是無法識別易位斷點發(fā)生的精確位置。本研究綜合利用這些技術(shù)清晰地識別了兩種經(jīng)輻射誘導(dǎo)的兩個小麥-百薩偃麥草易位類型，除明確了兩種小麥-百薩偃麥草染色體5J易位外，還發(fā)現(xiàn)小麥染色體的缺失和相互易位，三種技術(shù)相互印證，增加了鑒定的準(zhǔn)確性。物理作圖發(fā)現(xiàn)，2個共顯性標(biāo)記同時定位于5J和5A長臂頂端小片段，暗示兩條染色體具有很好的共線性。進一步篩選定位更多的5AL近端部特異標(biāo)記，有利于發(fā)現(xiàn)5AL存在的易位斷點，對進一步鑒定5JL斷點也具有重要的參考價值，充分體現(xiàn)了分子標(biāo)記在準(zhǔn)確鑒定易位斷點中的優(yōu)勢。Patokar等[17]利用中國春 ph1突變體誘導(dǎo)，選育出涉及5JL小片段易位到5AL上形成的小片段易位T5AS·5AL-5JL，與我們選育的易位系相比，其外源片段只占很小部分，而我們選育的易位系外源片段占很大部分。Li 等[18]報道，禾谷類作物染色體4L/5L存在的易位斷點可能代表一類染色體斷裂重接熱點。本研究以及國外科學(xué)家相繼育成涉及5JL不同類型易位系的報道，進一步證明5JL類似于谷類作物5L，可能同樣存在一個斷裂重接熱點，因此可以推測5J和5A的關(guān)系可能更近些，本研究已經(jīng)鑒定出涉及這兩條染色體的更多的易位類型。上述結(jié)果表明，綜合采用三種技術(shù)，可以取長補短，提高鑒定的效率和準(zhǔn)確性，為長期以來難以鑒定的復(fù)雜變異體的準(zhǔn)確識別提供了可靠的方法。研究還發(fā)現(xiàn)，除準(zhǔn)確鑒定了小麥-百薩偃麥草染色體易位外，從兩個材料中還發(fā)現(xiàn)明顯的小麥染色體變異，一種是6A缺失，另一種是6A和2D間的相互易位，充分反映了電離輻射誘發(fā)變異的復(fù)雜性。對于NAU16YJ124而言，除了包含一對缺失染色體del6AL外，6A缺失掉的片段易位到5JL上形成了小麥-百薩偃麥草易位T5JS·5JL-6AL，因此6A的遺傳信息是完整的，只是分成了兩個不同的區(qū)段，像這樣的復(fù)雜變異，單純利用分子標(biāo)記是無法識別的，但是細胞學(xué)標(biāo)記特別是本研究開發(fā)的寡核苷酸探針套可以清晰區(qū)分；同理，發(fā)生在NAU16YJ127中的6A和2D相互易位，也是靠細胞學(xué)標(biāo)記才能加以準(zhǔn)確區(qū)分，充分反映了寡核苷酸探針套涂染等細胞學(xué)鑒定技術(shù)的重要性。

1：中國春；2：中國春-百薩偃麥草雙倍體；3：DS5J(5A)；4:NAU16YJ127；5：NAU16YJ124；M：DL2000。長箭頭示5J特異條帶，短箭頭示5A特異條帶。

1:Chinese Spring; 2:CS-Th.bessarabicumamphiploid; 3:DS5J(5A); 4:NAU16YJ127; 5:NAU16YJ124;M:DNA ladder(DL2000).Long arrows indicate the 5J specific loci, and short arrows indicate the 5A specific loci.

圖3百薩偃麥草染色體5J的特異標(biāo)記(X5EST205,X5EST636,XZ2206)擴增結(jié)果

Fig.3Amplificationwithspecificmolecularmarkers(X5EST205,X5EST636,XZ2206)forchromosome5JofTh.bessarabicumL

圖4 百薩偃麥草5J染色體物理作圖(顯示紅色的標(biāo)記為共顯性標(biāo)記)

表2 21個百薩偃麥草染色體5J?；瘶?biāo)記的擴增結(jié)果Table 2 Amplification with 21 specific markers for Th.bessarabicum chromosome 5J

“0”表示沒有染色體5J或5A特異條帶，“1”表示有5J或5A特異條帶。

“0” indicates absence of the 5J- or 5A-specific loci, and “1” indicates presence of the specific loci.

小麥族植物第五群染色體定位了很多有利基因，例如籽粒硬度基因[19-21]、春化基因[22-23]、 Ph1基因[24-25]、光敏色素基因[26-27]等，初步研究發(fā)現(xiàn)，百薩偃麥草5J染色體導(dǎo)入小麥背景對小麥株高、穗型和耐鹽性等具有明顯影響[9, 15, 28]，但是這些基因尚未得到發(fā)掘和利用。本研究所鑒定的易位系涉及不同的外源區(qū)段，結(jié)合前期選育的其他變異體，為準(zhǔn)確鑒定和轉(zhuǎn)移利用5J染色體有利基因提供了重要的種質(zhì)資源。本研究物理定位的21個標(biāo)記，特別是定位于5JL和5AL頂端的共顯性標(biāo)記為進一步檢測染色體易位斷點、追蹤5JL特異區(qū)段提供了重要信息。

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