糖腎康對(duì)糖尿病大鼠腎組織保護(hù)的研究*

張?jiān)骑w，張 燕，婁 纓

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450008； 2.河南省人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003；3.原陽(yáng)縣食品藥品監(jiān)督管理局，河南 原陽(yáng) 453500)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病并發(fā)癥，每年發(fā)生率高達(dá)47.7%，己成為終末期腎衰竭死亡的主要原因[1]。目前缺乏DN的有效治療手段，探討其早期防治非常重要。糖腎康由生地黃、黃芪、槐米、大黃、益母草、山楂6種中藥材組成，具有益氣養(yǎng)陰、清熱祛濕、活血化瘀之效。本研究觀(guān)察了糖腎康對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠血糖、體質(zhì)量、腎臟肥大指數(shù)、腎臟病理形態(tài)學(xué)的影響，探討其對(duì)糖尿病腎病的防治效果及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

成年Wistar大鼠52只，清潔級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，由河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(豫)2013-002，飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。飼養(yǎng)室內(nèi)氨濃度小于20×10-6，室溫為17～21 ℃，相對(duì)濕度40%～65%。明暗周期12 h，自由飲食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分組飼養(yǎng)。

1.2 藥品、試劑與儀器

糖腎康組成：生地黃30 g,黃芪20 g,槐米30 g,大黃5 g,益母草20 g,山楂20 g。水煎兩次，合并藥液，濃縮為含生藥2 g/mL的藥液，4 ℃以下貯存?zhèn)溆谩Ｒ滥瞧绽?0 mg/片，揚(yáng)子江制藥股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)08011003。鏈脲佐菌素(STZ)，美國(guó)Sigma公司，購(gòu)自北京博奧森生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，批號(hào)L09838，使用時(shí)以0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液新鮮配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 g/L的 STZ溶液，pH值4.2。檸檬酸,上海浦口化學(xué)試劑有限公司提供，批號(hào)200110628；檸檬酸三鈉,西安化學(xué)試劑廠(chǎng)產(chǎn)品，批號(hào)011108。RightestTu血糖儀，華廣公司產(chǎn)品,機(jī)號(hào)230GK4065；RightestTu檢測(cè)試紙條,華廣公司產(chǎn)品,批號(hào)1189151。UV-120-02型 HANGPING電子秤，上海精科公司天平儀器廠(chǎng)產(chǎn)品；BM2135型石蠟切片機(jī)，LEICA產(chǎn)品；BS60型光學(xué)顯微鏡及顯微鏡攝像系統(tǒng)，OLYMPUS公司產(chǎn)品。

1.3 模型的建立與分組

成年52只Wistar大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，尾靜脈取血測(cè)量血糖，血糖值均正常(≤7.0 mmol/L)。隨機(jī)取10只作為正常對(duì)照組，余42只造模。方法：大鼠禁食不禁水12 h，一次性單側(cè)腹腔注射新鮮配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 g/L的 STZ溶液(50 μg/g)，正常對(duì)照組注射等體積的0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液。72 h后經(jīng)大鼠尾靜脈采血，測(cè)血糖值。以隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L為大鼠DM模型成功。造模大鼠死亡3只，將剩余39只大鼠隨機(jī)分成模型對(duì)照組、依那普利組、糖腎康組3組，每組13只。

1.4 給藥方法

模型成功后，將所有動(dòng)物在同一條件下(保持溫度20～40 ℃，相對(duì)濕度40 %，12 h交替照明，保持墊料干燥)以普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，控制飼料。成模24 h后，開(kāi)始灌胃。灌胃劑量按大鼠與人體表面積比折算成大鼠等效劑量[大鼠與人的體表面積比為0.018，人用劑量×0.018×5=大鼠所用標(biāo)準(zhǔn)劑量(g/kg)，取標(biāo)準(zhǔn)劑量的2倍為實(shí)驗(yàn)治療劑量]。糖腎康組給以糖腎康藥液5.4 g/(kg·d)(人用劑量30 g/d)灌胃，依那普利組給以依那普利3.6 μg/(g·d)(人用劑量20 mg/d)溶于等體積蒸餾水，灌胃；正常對(duì)照組與模型對(duì)照組以等體積蒸餾水灌胃。1 d 2次,連續(xù)56 d。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

觀(guān)察大鼠一般情況，即體質(zhì)量、食量、飲水量、尿量、形態(tài)、毛發(fā)、精神狀態(tài)和活躍程度等。灌胃開(kāi)始后第7天、第28天、第56天測(cè)體質(zhì)量(電子稱(chēng)測(cè)量)、血糖(尾靜脈取血，血糖儀測(cè)定)。第56天，脫頸椎處死全部大鼠，取大鼠左腎，用電子稱(chēng)稱(chēng)量質(zhì)量；經(jīng)腎門(mén)冠狀面取組織，100 g/L 中性甲醛固定，石蠟包埋，切4 μm厚片，HE染色，采用光學(xué)顯微鏡觀(guān)察腎臟組織形態(tài)學(xué)，顯微鏡攝像系統(tǒng)閱片、拍照。腎臟肥大指數(shù)=腎質(zhì)量/體質(zhì)量×103。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況對(duì)比

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中正常對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好，強(qiáng)壯肥碩，毛發(fā)光澤，活潑好動(dòng)。與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組、依那普利組、糖腎康組出現(xiàn)明顯的多飲多食和消瘦癥狀，精神不振，毛發(fā)枯槁，行動(dòng)遲緩；但糖腎康組呈逐漸好轉(zhuǎn)的態(tài)勢(shì)，灌胃開(kāi)始后第49天時(shí)，大鼠飲水、食量接近正常。造模后3只大鼠死亡，分別死亡于造模后6 h、10 h、48 h。模型對(duì)照組有1只大鼠在灌胃開(kāi)始后第15天死亡，考慮死亡原因?yàn)楦腥竞透哐撬碌耐Y酸中毒，正常對(duì)照組、依那普利組、糖腎康組無(wú)死亡，總死亡率為7.69%。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量、腎臟肥大指數(shù)對(duì)比

實(shí)驗(yàn)期間，正常對(duì)照組大鼠體質(zhì)量逐漸增加，模型對(duì)照組、依那普利組、糖腎康組體質(zhì)量逐漸減輕，其中糖腎康組減輕較為緩慢。第56天時(shí)，糖腎康組體質(zhì)量已明顯高于依那普利組(P<0.05)、模型對(duì)照組(P<0.01)。第56天時(shí)，模型對(duì)照組、依那普利組、糖腎康組腎臟肥大指數(shù)均高于正常對(duì)照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；模型對(duì)照組腎臟肥大指數(shù)最高，分別與依那普利組、糖腎康組對(duì)比，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；糖腎康組腎臟肥大指數(shù)低于依那普利組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1、表2。

組別n第7天第28天第56天正常對(duì)照組10210．80±17．27221．30±17．08236．80±18．91＊＊模型對(duì)照組12175．33±18．92??165．91±18．40??140．91±18．68??＊＊依那普利組13188．00±12．11??172．23±13．70??144．46±18．75??＊＊糖腎康組13181．46±17．94??170．23±17．33??162．70±18．40??##△＊

注：與同期正常對(duì)照組對(duì)比，**P<0.01；與同期模型對(duì)照組對(duì)比，##P<0.01；與同期依那普利組對(duì)比，△P<0.05；與同組第7天對(duì)比，＊P<0.05

組別n腎臟肥大指數(shù)正常對(duì)照組103．10±0．30模型對(duì)照組126．04±0．64??依那普利組134．69±0．33??##糖腎康組134．26±0．35??##△△

注：與正常對(duì)照組對(duì)比，**P<0.01；與模型對(duì)照組對(duì)比，##P<0.01；與依那普利組對(duì)比，△△P<0.01

2.3 各組大鼠血糖對(duì)比

不同時(shí)期模型對(duì)照組、依那普利組、糖腎康組的血糖均高于同時(shí)期的正常對(duì)照組，且維持在較高水平，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。第7天、第28天、第56天糖腎康組血糖逐漸降低，且第56天血糖明顯低于第7天，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；糖腎康組第28天，第56天的血糖與同期模型對(duì)照組、依那普利組對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表

3 各組大鼠不同時(shí)期血糖對(duì)比

組別n第7天第28天第56天正常對(duì)照組104．55±0．814．78±0．794．41±0．72模型對(duì)照組1227．51±2．38??26．76±2．03??28．18±2．16??依那普利組1326．72±2．32??26．28±2．47??26．62±2．06??糖腎康組1325．70±4．32??23．02±2．95??##△△19．53±2．21??##△△＊

注：與同期正常對(duì)照組對(duì)比，**P<0.01；與同期模型對(duì)照組對(duì)比，##P<0.01；與同期依那普利組對(duì)比，△△P<0.01；與同組第7天對(duì)比，＊P<0.05

2.4 各組腎臟組織形態(tài)學(xué)對(duì)比

第56天時(shí)模型對(duì)照組、依那普利組、糖腎康組的腎臟腫大，包膜緊張，剖面呈充血狀，以腎皮質(zhì)為重，皮、髓質(zhì)界限尚清。光鏡下：正常對(duì)照組的腎小球橢圓形，輪廓規(guī)則整齊，分布均勻，系膜區(qū)無(wú)擴(kuò)張，腎小管正常。模型對(duì)照組的腎小球體積增大，結(jié)構(gòu)紊亂，彌漫性的系膜區(qū)增寬，基底膜增厚，細(xì)胞外基質(zhì)增多,毛細(xì)血管擴(kuò)張，腎小管細(xì)胞肥大，出現(xiàn)空泡樣變性。依那普利組、糖腎康組較模型對(duì)照組輕，其中糖腎康組整體印象接近于正常。見(jiàn)圖1。

3 討 論

糖尿病腎病屬中醫(yī)學(xué)“消渴”“腎濁”范疇。筆者認(rèn)為糖尿病腎病的基本病機(jī)為氣陰兩虛、血瘀濕熱。氣陰兩虛為本，血瘀濕熱為標(biāo)。早期陰虛燥熱，日久則傷陰耗氣，致氣陰兩虛。腎氣不固，經(jīng)脈失養(yǎng)，絡(luò)脈瘀阻。津血同源，互為資生轉(zhuǎn)化，燥熱傷津，津虧液少，勢(shì)必不能載血循經(jīng)暢行；燥熱內(nèi)灼，煎熬營(yíng)血，又可導(dǎo)致血瘀。另外，長(zhǎng)期水谷精微隨尿下泄，精氣大傷，氣虛則無(wú)法推動(dòng)血流，出現(xiàn)血脈瘀滯；而陰虛化火，又灼傷絡(luò)脈，致瘀熱阻絡(luò)。氣陰兩虛，血脈瘀阻，則下焦運(yùn)化失司，水濕內(nèi)停，加之燥熱，則濕熱下淫。治療上通常標(biāo)本兼顧，治標(biāo)時(shí)尤其重視活血化瘀之法，使瘀去絡(luò)通，諸瘀所致之病理產(chǎn)物也可漸消，兼顧清熱利濕，邪去則正安。因此，治療時(shí)在嚴(yán)格控制血糖、控制血壓、限制蛋白攝入量的基礎(chǔ)上，運(yùn)用中藥，對(duì)防止和延緩DN的發(fā)生、發(fā)展，延緩腎功能下降速度有著重要的意義。糖腎康以生地黃、黃芪二藥為君，臣以槐米、大黃，佐以益母草、山楂，全方共奏益氣養(yǎng)陰、清熱祛濕、活血化瘀之效。方中生地黃味甘、苦、性寒，入心、肝、腎三經(jīng)，主要功用為養(yǎng)陰生津，清熱涼血消瘀。生地黃治療消渴早在唐代著名醫(yī)家孫思邈所著的《千金要方》中就有記載。《本經(jīng)》謂干生地黃“味甘、寒，主折跌絕筋，傷中逐血痹，……,生者尤良”，可以看出干地黃尤其是鮮地黃有逐血痹、消瘀療傷作用。黃芪性味甘溫，被列為本草上品，有補(bǔ)氣健脾、升陽(yáng)固本、托毒生肌、利水消腫的功效；此外，尚有“逐五臟間惡血”(《別錄》)、“通調(diào)血脈，流行經(jīng)絡(luò)”(《本經(jīng)逢原》)等功效。《千金方》載黃芪湯為專(zhuān)治消渴而設(shè)。槐米是豆科植物槐樹(shù)的干燥未開(kāi)花的花蕾，功能清熱、祛濕、涼血、止血。大黃苦，寒，有清熱瀉火、活血化瘀、解毒之功，佐以益母草、山楂以增強(qiáng)利水消腫、活血化瘀作用。

本研究從以下幾個(gè)方面闡述糖腎康對(duì)DN的保護(hù)。首先，糖尿病腎病腎臟肥大是出現(xiàn)最早、最明顯的腎臟病理改變，能否控制糖尿病腎臟肥大，是本病治療有無(wú)成效的標(biāo)志之一。腎臟肥大指數(shù)是衡量腎臟肥大較客觀(guān)的指標(biāo)，可以排除因每個(gè)動(dòng)物本身的腎臟隨月齡增加而增長(zhǎng)的因素，使表示腎重增長(zhǎng)的參數(shù)更為客觀(guān)[2]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，糖尿病模型大鼠經(jīng)糖腎康治療后，腎臟肥大指數(shù)有明顯降低，與同期模型對(duì)照組對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。依那普利為新一代的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，口服后在體內(nèi)分解成依那普利拉，可以抑制血管緊張素Ⅱ的合成，擴(kuò)張微血管，降低腎小球內(nèi)壓，減少腎小球硬化細(xì)胞因子的合成和分泌。早期應(yīng)用依那普利可以延緩DN的發(fā)生、發(fā)展[3-4]。本實(shí)驗(yàn)支持依那普利對(duì)DN具有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，糖腎康可使糖尿病模型大鼠的腎臟肥大得到控制，且療效優(yōu)于依那普利組(P<0.01)，推測(cè)是糖腎康中各藥協(xié)同，降低了糖尿病大鼠腎血漿流量，改善了腎小球早期高濾過(guò)、高灌注狀態(tài)，從而防止了DN的發(fā)生和發(fā)展。其次，大量的研究表明，糖代謝紊亂是糖尿病慢性并發(fā)癥包括DN的啟動(dòng)因素，也是DN發(fā)生和發(fā)展的基本因素；過(guò)多的葡萄糖集中在腎組織是導(dǎo)致DN的根本原因[5]。控制高血糖是防治DN的一項(xiàng)基本措施。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，糖腎康具有一定的降低血糖作用，并隨治療時(shí)間的延長(zhǎng)，降糖作用更明顯。第56天時(shí)，糖腎康組大鼠的血糖與依那普利組、模型對(duì)照組對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。再次，糖腎康組大鼠體質(zhì)量降低的態(tài)勢(shì)逐漸變緩，到第56天時(shí)，體質(zhì)量已明顯區(qū)別于依那普利組(P<0.05)和模型對(duì)照組(P<0.01)。考慮可能是血糖的控制導(dǎo)致高滲性利尿的原因。最后，在DN早期，多種因素導(dǎo)致腎臟固有細(xì)胞肥大，以后逐漸出現(xiàn)腎小球基底膜增厚和腎小球系膜區(qū)為主的細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行性積聚；而腎臟固有細(xì)胞的增殖、肥大和凋亡在DN發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[6]。腎實(shí)質(zhì)體積增大是DN早期重要的病理特征。本實(shí)驗(yàn)中糖腎康可使腎小球體積、系膜區(qū)和腎小管擴(kuò)張程度減輕，其效果較依那普利更明顯。

綜上所述，糖腎康對(duì)糖尿病腎病具有保護(hù)作用。

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