基于UPLC方法同時測定準噶爾柳花中的蘆丁、木犀草苷、綠原酸、槲皮素含量

韓飛，王苗苗，毛瓊玲，張倩，李慕春*

(1.新疆維吾爾自治區分析測試研究院,新疆 烏魯木齊 830011;2.新疆天然產物綠色加工工程技術研究中心，新疆 烏魯木齊 830011)

準噶爾柳(Salixsongarica)是楊柳科柳屬的植物,分布在中亞地區、伊朗、阿富汗以及中國大陸的新疆等地，生長于海拔1 100～1 150 m的地區，多生在平原河谷以及荒漠小河邊，目前尚未由人工引種栽培[1]。準噶爾柳是重要的藥用植物，同楊柳科其他植物一樣樹皮可提取水楊甙[2～4]。水楊甙被稱為“天然阿司匹林”，用于治療輕微發熱、感冒、感染、急性和慢性風濕不適等病癥[5～6]。準噶爾柳花為準噶爾柳的干燥花序，具有清肺化痰、清熱解暑、止咳安神的功效，當地維吾爾族居民常常將準噶爾柳花作為一種茶。目前，對準噶爾柳花的研究還未見報道。前期對柳花提取物進行系統預實驗，發現柳花中黃酮含量較高[7]，其中黃酮類成分如蘆丁[8]、槲皮素[9]、綠原酸[10]等具有降血脂、抗腫瘤、降血糖、抗氧化等生物活性，木犀草苷[11]亦有抗癌細胞增殖、誘導癌細胞凋亡和凋亡增敏作用。本文利用UPLC對準噶爾柳花的水提取物和70%醇提取物中的黃酮成分進行液相檢測，建立一種UPLC對準噶爾柳花中的蘆丁、木犀草苷、綠原酸和槲皮素含量同時測定的方法，以期對準噶爾柳花的開發提供科學依據。

1 材料與儀器

1.1 藥材

準噶爾柳花2016年9月采自新疆烏蘇市，經新疆維吾爾自治區分析測試研究院天然產物所阿依古麗副研究員鑒定為楊柳科柳屬準噶爾柳花，流式粉碎機粉碎過40目，待用。

1.2 試劑

蘆丁(中國食品藥品檢定研究院，批號100080-201408)、木犀草苷(中國食品藥品檢定研究院，批號111720-200604)、綠原酸(成都曼思特生物科技有限公司,批號: 14091701)、槲皮素(成都曼思特生物科技有限公司,批號12020101)、無水乙醇、乙酸均為分析純，甲醇、乙腈均為色譜純，水為超純水。

1.3 儀器

超高效液相色譜儀(美國Waters)；冷凍干燥機ALPHA2-4(德國CHRIST)；旋轉蒸發儀(瑞士BUCHI)；電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；電熱恒溫水浴鍋HHS(上海博訊實業有限公司)；冷卻水循環機H50(萊伯泰科公司)；流水式粉碎機DYQ-188(瑞安市永歷制藥機械有限公司)。

2 方法與結果

2.1 供試樣品的制備

稱取凍干粉2.5 mg于25 mL的容量瓶中，甲醇溶解定容，配置成100 μg/mL的柳花水提、柳花醇提供試液。

2.2 標準品溶液及混合標準品溶液的配制

2.2.1 標準品溶液的配制

精密稱取對照品蘆丁、木犀草苷、綠原酸、槲皮素，分別用甲醇溶解定容至10 mL容量瓶中，搖勻，即得4個成分母液；再精密吸取蘆丁、木犀草苷、綠原酸、槲皮素母液分別用甲醇定容到10 mL，得蘆丁、木犀草苷、綠原酸、槲皮素200 μg/mL對照品儲備液。

2.2.2 混合對照品的配制

分別吸取蘆丁、木犀草苷、綠原酸、槲皮素 2.5 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18100 mm×2.1 mm，1.7 μm；流動相：乙腈(A)-0.2%乙酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～4 min，5%A→14%A；4～15 min，14%A→23%A；15～20 min，23%A→35%A；20～22 min，35%A→55%A；22～23 min，55%A→5%A；23～25 min，5%A)；流速：0.29 mL/min；檢測波長：360 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：3 μL。

2.4 系統適用性考察

分別量取混合對照品溶液、供試樣品溶液注入色譜儀，記錄色譜圖(圖1)，結果蘆丁、木犀草苷、綠原酸、槲皮素與樣品中的其他成分能較好地分離。理論板數按蘆丁、木犀草苷、綠原酸、槲皮素峰計算均不低于3 000。

1 綠原酸； 2 蘆丁； 3 槲皮素； 4 木犀草苷。圖1 混合對照品和供試品溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed reference substance and test sample solution

2.5 標準曲線的制備

精密吸取混合對照品溶液0、2、4、6、8、10 mL，分別置于10 mL的刻度比色管中，甲醇定容至刻度，搖勻，配置成系列濃度的混合對照品溶液，進樣3 μL，測定峰面積，以峰面積為縱坐標，對照品濃度為橫坐標繪制標準曲線，結果見表1。

表1 各組分標準曲線、相關系數、線性范圍Table 1 Standard curves,correlation coefficients and linear range of each component

2.6 精密度實驗

精密吸取混合對照品溶液3 μL，按2.3下色譜條件連續進樣6次，測定待測成分峰面積，取6次數據進行計算，得出蘆丁、木犀草苷、綠原酸、槲皮素的相對標準偏差。結果蘆丁、木犀草苷、綠原酸、槲皮素峰面積的相對標準偏差分別為1.86%、1.61%、1.30%、1.51%，表明儀器的精密度良好。

2.7 穩定性實驗

取同一供試溶液室溫下放置0、1、3、5、7、9 h 后3 μL，按2.3條件進樣，考察各化合物的穩定性。蘆丁、木犀草苷、綠原酸、槲皮素峰面積的相對標準偏差分別為1.40%、1.07%、0.93%、0.78%，表明供試溶液在9 h內相對穩定。

2.8 重復性實驗

選取同一批樣品6份，精密稱量，按2.1制備供試溶液，按2.3條件進行測定，計算待測成分的含量。結果樣品中蘆丁含量為5.633 mg/g，相對標準偏差為1.2%；木犀草苷含量為1.841 mg/g，相對標準偏差為1.5%；綠原酸含量為0.994 mg/g，相對標準偏差為2.4%；槲皮素含量為2.242 mg/g，相對標準偏差為1.6%。結果表明，方法的重復性良好。

2.9 加標回收實驗

精密移取混合對照溶液1 mL 6份于250 mL錐形瓶中，用氮氣吹干，在各個錐形瓶中加入已知含量的準噶爾柳花粉末0.5 g，按2.1所述制備供試溶液，按2.3所述條件進樣，計算回收率。結果蘆丁、木犀草苷、綠原酸、槲皮素平均加標回收率(n=6)，分別為99.9%、98.8%、97.6%、99.0%，相對標準偏差為1.6%、0.8%、1.7%、2.0%。

3 討論

本實驗采用PDA檢測器進行全波長掃描(190 nm～450 nm)，結果360 nm處4個成分具有較大的吸收，雜質成分干擾少，故選擇360 nm作為檢測波長。流動相優選甲醇-甲酸水、乙腈-甲酸水、甲醇-乙酸水、乙腈-乙酸水等流動相系統，最終選擇乙腈-0.2%乙酸水溶液為流動相，梯度洗脫為洗脫方式，樣品分離度好。

含量測定時，蘆丁、木犀草苷、綠原酸、槲皮素4種成分在準噶爾柳花中的含量表現出了較大的差異，從結果可以看出準噶爾柳花中蘆丁含量最高，槲皮素含量僅次于蘆丁。

本研究采用了梯度洗脫的方法同時測定柳花中蘆丁、木犀草苷、綠原酸和槲皮素的含量，不僅簡單、快速，而且分離度較好、適用面廣。目前未見報道。從供試樣品色譜圖可以看出，目標峰分離效果較好,峰面積與濃度呈正相關，精密度、 穩定性、重復性和回收率的測定均符合實驗要求。實驗結果可用于新疆準噶爾柳花中含量的測定，為質量綜合評價及藥效的科學解釋提供了準確、快速的定量分析方法，也為其質量控制提供了科學依據。從供試樣品的色譜圖中還可以看出，除已知的蘆丁、木犀草苷、綠原酸和槲皮素外，至少還有兩種含量較高的物質有待進一步研究確定。

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