茶樹紫芽中多種花色苷組分同時檢測方法的建立

劉林峰

周 陽1,2

林 玲1,2

肖文軍1,2,3

龔志華1,2

(1.湖南農業大學茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2.湖南農業大學國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128；3.湖南農業大學湖南省植物功能成分利用協同創新中心，湖南 長沙 410128)

花色苷是植物的主要呈色物質[1]。花色苷在茶樹中具有普遍性，是茶樹抗逆生理的表現形式之一[2]。花色苷具有很好的生物活性[3]，成為近年茶葉功能成分研究的熱點。茶樹芽葉中花色苷分析方法迄今還沒有標準，參照其他植物花色苷分析方法[4]，其定性分析方法主要有紙層析、薄層層析、紫外-可見吸收光譜[5]等；定量分析方法主要有單一pH值法、差減法、pH示差法及高效液相色譜法等[6-7]。在眾多方法中，高效液相色譜法具有高靈敏度、分析速度快等突出優點，且能與其他分析設備聯用，如Eva[8]、Chandra[9]等都曾建立高效液相色譜與其他設備譜聯用的方法來分析植物中的花色苷。Sakamoto 等[10]也使用HPLC分析哈斯卡普茶花色苷含量。Lee等[11]用pH示差法和HPLC同時分析了含有花色苷的果汁，建立了2種分析方法的相關性。中國高效液相色譜分析植物中花青素也有應用，如張芳軒[12]、江連洲[13]、李琪[14]、徐學玲[15]等分別用HPLC分析了黑米種皮、紫甘薯、釀酒葡萄、紫色小白菜中花色苷組分，說明高效液相色譜是當下較為普遍的分析植物花色苷的方法。

茶葉花色苷的高效分析方法一直在探索中，也有人用HPLC分析茶葉中花色苷組分，龔加順等[16]采用HPLC分析茶葉中花色苷，初步探究了HPLC分析茶葉花色苷組分。但目前的分析大都是以單一矢車菊為標準品，分析單一的茶樹品種。本研究針對上述問題，擬以3種花色苷外標為標準品，建立同時分析多種紫芽茶樹花色苷組分的HPLC分析方法，以期為指導紫芽茶樹花色苷組分分析、高純單體的分離鑒定提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

茶樣：紫娟、自選9803、紅芽佛手、安73，湖南農業大學長安實踐教學基地茶樹資源圃和湖南省茶葉研究所高橋茶樹資源圃，采摘標準為一芽三葉。茶梢冷凍干燥后制成干粉，塑料袋密封后保存于冰箱中，備用。

1.2 試劑及儀器設備

1.2.1 藥品試劑

乙腈、磷酸、甲醇、無水乙醇：分析純，天津市恒興化學試劑制造有限公司；

乙腈、甲醇：色譜純，天津市恒興化學試劑制造有限公司；

標準品矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷：北京譜析科技有限公司；

飛燕草素-葡萄糖苷：西寶生物科技(上海)股份有限公司；

超純水：自制；

酸性乙醇水溶液(85 mL無水乙醇加15 mL 1%鹽酸水)：自配。

1.2.2 儀器設備

旋轉蒸發器：SY-2000型，上海亞榮生化儀器廠；

高效液相色譜儀：LC-20A型，日本島津公司；

茶葉揉捻機：40型，浙江上洋機械股份有限公司；

水浴鍋：DSY-2-8型，北京國華醫療器械廠；

冷凍干燥機：MODULYOD-230型，美國Thermo Fisher Sciebtific公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品花色苷的提取與純化 參照文獻[17～18]和預試驗結果，采用回流提取的方法提取紫芽茶樹一芽三葉干粉中的花色苷，提取條件為80%乙醇(添加1%冰乙酸水)、1∶50 (g/mL)料液比、80 ℃下回流提取60 min，過濾取濾液，并依次用配比為正己烷∶乙酸乙酯∶水=1∶1∶2(體積比)的溶劑萃取脫脂至有機層無色。水層低溫旋轉蒸發濃縮，用甲醇定容至2 mL，0.45 μL有機濾膜過膜，裝入進樣瓶中待HPLC 分析。

1.3.2 標準品溶液的配制 分別取1 mg 3種花色苷標準品，分別用甲醇溶解定容至10 mL；每種標準品溶液各吸取1 mL 混合定容至10 mL，混合均勻，得到混合標準溶液，備用。

1.3.3 茶樹紫芽花色苷HPLC分析方法的建立

(1) 檢測波長的確定：根據文獻[19]，用紫外分光光度計對3種標準品溶液進行全波長掃描，選擇最適合的分析波長。

(2) 流動相的優化：根據文獻[20]，控制有機相洗脫梯度為0～55 min、10%～40%，流速 0.8 mL/min，柱溫 30 ℃和紫外檢測波長 520 nm等其他色譜條件不變，按照表1方案，選用的流動相不同配比，分析比較流動相對樣品分離度及柱效的影響。

表1 不同流動相設計方案Table 1 Designs of different mobile phases

(3) 洗脫梯度的調節：根據文獻[7]，以乙腈和0.2%磷酸超純水作流動相梯度洗脫，控制流速 0.8 mL/min，柱溫 30 ℃，紫外檢測波長 520 nm等色譜條件不變，按表2方案，分析不同洗脫梯度下的樣品分離度及柱效情況，選擇最優的洗脫梯度。

表2 不同洗脫程序設計方案Table 2 Designs of different elution procedures

(4) 流速的選擇：根據文獻[20]，以乙腈和0.2%磷酸超純水作流動相梯度洗脫，控制有機相洗脫梯度為0～55 min、10%～40%，柱溫 30 ℃，紫外檢測波長 520 nm等其他色譜條件不變，分析流速(0.8，1.0，1.2 mL/min)對樣品分離度及柱效的影響。

(5) 柱溫的選擇：根據文獻[20]，以乙腈和0.2%磷酸超純水作流動相梯度洗脫，控制有機相洗脫梯度為0～55 min、10%～40%，流速 0.8 mL/min，紫外檢測波長 520 nm等其他色譜條件不變，分析柱溫(20，25，30 ℃)對樣品分離度及柱效的影響。

1.3.4 方法學考察

(1) 標準曲線的制作：將1.3.2配制好的混合標準品溶液過膜，用1.3.3中獲得的最優色譜條件分別進樣5，10，15，20，25，50 μL，繪制標準曲線。

(2) 精密度分析：分別配制3種標準品，分別在最優色譜條件下同日內5個不同時間點進行進樣分析，由測得的面積(A)計算標準偏差(SD)和相對標準偏差(RSD)，獲得日內精密度值。

(3) 重復性分析：按1.3.1的方法，4種紫芽茶樹用同一批茶樣制備6份不同花色苷提取液在最優色譜條件下進樣，由測得的面積(A)計算相對標準偏差(RSD)，分析重復性。

(4) 穩定性分析：配制3種標準品的混合標準溶液，室溫靜置，分別于0，2，4，6，8，12，24 h進樣，由測得的面積(A)分析溶液穩定性。

(5) 樣品回收率分析：稱取 6份已測定了花色苷含量的茶樣1 g，按1.3.1 方法制備供試溶液，加入適量混合標準液，在最優色譜條件下進樣，重復6次，分析樣品回收率。

1.3.5 紫芽茶樹茶梢樣品花色苷液相色譜法含量分析 按照1.3.1制備4種茶樣待測液，進樣10 μL，重復3次，計算茶樣中花色苷含量。計算公式：

(1)

2 結果與分析

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 檢測波長的確定 通過HPLC中全波長掃描可知(圖1)，飛燕草素的紫外最大吸收波長在275，524 nm左右，矢車菊素的紫外最大吸收波長在281，516 nm左右，天竺葵素的最大吸收波長在266，513 nm左右，要同時測定3種標準品以及樣品中的花色苷，考慮到各組分的靈敏度并避免其他多酚組分干擾，選擇520 nm波長作為檢測波長較為合適。

圖1 3種標準品紫外可見光譜圖Figure 1 UV-visible spectrums of three standard products

2.1.2 流動相的優化 如圖2所示，甲醇、50%乙腈、乙腈均可實現各花色苷成分的分離，考慮到乙腈洗脫能力更強，故選擇乙腈為有機相。水相磷酸濃度對組分分離影響不大，但在水中加入一定體積的酸，調節流動相的酸堿度可達到減少小峰拖尾和提高分離度的效果，故選擇0.2%磷酸水做水相。綜上，選擇方案4為最佳流動相方案。

圖2 不同流動相方案HPLC圖Figure 2 HPLC chromatograms of different mobile phase solutions

2.1.3 洗脫梯度的調節 如圖3所示，方案1和方案2有機相比率過高，各組分分離度相對較差，方案3耗時過長，與方案4相比效率過低，綜合來說方案4花色苷組分分離度和分離效率最佳，故選擇方案4，即有機相洗脫梯度為：0～55 min，10%～40%為最佳洗脫方案。

2.1.4 流速的選擇 不同流速方案的HPLC圖見圖4。結果表明，流速越快，雖然會使目標物質的分離時間相對縮短，但樣品各組分分離度降低，故選擇0.8 mL/min為最適流速。

2.1.5 柱溫的選擇 不同柱溫方案的HPLC圖見圖5。結果表明，柱溫越高，色譜分析出峰時間會更快，但高柱溫HPLC調節柱溫耗時過多，故選擇相對效率較好的30 ℃為系統柱溫。

圖3 不同洗脫程序方案HPLC圖Figure 3 HPLC chromatograms of different elution procedures

2.2 方法學考察

2.2.1 標準曲線的制作與檢出限 以進樣量為x軸，峰面積為y軸，繪制花色苷混合標準曲線，見表3。由表3可知，在5～75 μg/L范圍內，3種標準品都表現出良好的線性關系。

表3 不同花色苷標準品線性關系表Table 3 Linear relationship of different anthocyanin standards

圖4 不同流速方案HPLC圖Figure 4 HPLC chromatograms of different flow rate

圖5 不同柱溫方案HPLC圖Figure 5 HPLC chromatograms of different column temperature

2.2.2 精密度分析 由表4可知，在520 nm波長下，3種標準品的RSD都在8%內，表明本方法精密度良好。

表4 精密度分析結果Table 4 Results of precision analysis

2.2.3 重復性分析 由表5可知，在520 nm波長下，4種紫芽茶樹樣品中總花色苷的RSD均在9.04%之內，表明本方法重復性良好。

2.2.4 穩定性分析 由表6可知，室溫靜置下，520 nm波長下飛燕草素、矢車菊素和天竺葵素的RSD均≤9%，表明本方法穩定性良好。

2.2.5 回收率分析 由表7可知，3種外標花色苷在本方法下加標回收率為75%～88%，到達色譜分析要求，說明本方法結果可靠。

2.3 紫芽茶樹茶葉樣品中花色苷含量的檢測

根據1.3.1中的方法等到的茶樹花色苷溶液，按1.3.5的方法重復3次，不同茶樣中花色苷含量，結果見表8和圖6。由HPLC色譜圖可以看出，4種紫芽茶樹樣品中的7種主要花色苷均得到有效分離。從結果可以看出不同茶樹品種(系)所富集的花色苷含量存在顯著差異，花色苷含量的高低表現為紫娟>自選9803>安73>紅芽佛手，與紫芽茶樹品種(系)芽葉發紫程度的深淺基本一致，說明此方法適合分析紫芽茶樹中花色苷含量。

表5 重復性分析結果Table 5 Results of repeatability analysis

表6 穩定性分析結果Table 6 Results of stability analysis

表7 回收率分析結果Table 7 Results of recovery analysis

3 結論

本研究利用高效液相色譜法建立了同時檢測4種紫芽茶樹花色苷組分的HPLC分析方法：茶梢樣品先經酸性80%乙醇水回流提取、正己烷和乙酸乙酯脫脂，然后采用 C18色譜柱，以乙腈和0.2%磷酸超純水作流動相梯度洗脫，有機相洗脫梯度為0～55 min、10%～40%，流速 0.8 mL/min，柱溫 30 ℃，紫外檢測波長 520 nm，4種紫芽茶樹品種(系)中各花色苷組分和標準品在本方法下分離效果良好，相關系數均≥0.99，線性范圍為 5.00～75.00 μg/L，樣品加標回收率為75%～88%，該方法精密度、重復性和穩定性的相對標準偏差值≤10%。紫芽茶樹檢測結果表明，花色苷含量的高低表現為紫娟>自選9803>安73>紅芽佛手，與紫芽茶樹品種(系)芽葉發紫程度的深淺基本一致。

表8 不同樣品花色苷含量差異Table 8 Analysis of anthocyaninscontents in different samples (n=3)

圖6 不同品種樣品和混合標樣的花色苷HPLC色譜圖Figure 6 Comparison of anthocyanin components differences in different tea varieties and mixed standard

本研究使用的C18為常見色譜柱，購買方便，流動相為乙腈和磷酸水，容易配制，同時也降低了對試驗儀器的要求，可用于同時檢測分析矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷、飛燕草素-葡萄糖苷3種植物花色苷和紫芽茶樹中多種花色苷組分。

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