蒲公英總黃酮復合酶酶法提取工藝及抗氧化活性研究

張 智

劉 洋1

尹文哲2

化洪苓1

遇恒林3

張志軍3

(1.東北林業大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱醫科大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150086；3.哈爾濱天合力制藥有限公司，黑龍江 哈爾濱 150001)

蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)為菊科蒲公英屬植物，別名婆婆丁、丁奶奶、燈籠草及奶汁草等，分布廣泛，幾乎遍及中國多數地區[1-2]，是一種常見的藥食兩用植物。蒲公英化學成分豐富，包括黃酮類、酚酸類物質、萜類、色素類、植物甾醇類、香豆素類等[3]。黃酮類化合物泛指一類存在于自然界的、具有2-苯基色原酮(flavone)結構的化合物[4]，其具有抗自由基、抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理作用[5-7]，針對富含黃酮類活性物質天然產物的開發利用已成為功能性食品的研究熱點。

目前對蒲公英中黃酮類活性物質的提取工藝研究很多，大多采用乙醇-水溶劑提取法[8]、超聲波輔助提取法[9]21、微波提取法[9]22-23[10]。乙醇價格便宜，易于回收，但乙醇提取總黃酮效果并不是很好，在加熱狀態下易產生雜質增加后期分離難度；與有機溶劑提取方法相比，超聲波提取法具有用時短、提取率高等優點，但超聲溫度不容易控制；微波提取法的瞬時加熱方式可大大縮短提取時間、減小溶劑用量，從而加大提取率，但瞬時加熱可能使有些活性成分變性。此外，酶解法由于酶具有高效性和專一性，近幾年也廣泛用于總黃酮的提取[11-14]，而用復合酶酶法提取蒲公英總黃酮的研究還未見報道。

本試驗擬選取乙醇溶液為提取溶劑，在單因素試驗基礎上，利用響應面優化蒲公英總黃酮超聲波輔助提取工藝，并通過分析蒲公英總黃酮的DPPH自由基清除能力和總還原能力2個指標評價其抗氧化活性，為蒲公英黃酮類化合物的研究及開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、試劑與儀器

蒲公英：哈爾濱天合力制藥有限公司；

纖維素酶：1.40×106U/g，北京博奧拓達科技有限公司；

果膠酶：1.0×105U/g，北京博奧拓達科技有限公司；

亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇：分析純，天津市巴斯夫化工有限公司；

干燥箱：DZF-6092型，上海一恒科學儀器有限公司；

電子天平：FA2004B型，上海佑科儀器儀表有限公司；

pH計：SJ-3F型，上海圣科儀器設備有限公司；

水浴震蕩器：SHA-B型，常州市億能實驗儀器廠；

超聲波清洗器：KQ-300DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

離心機：TDL-4ZA型，湖南星科科學儀器有限公司；

紫外-可見光分光光度計：722型，上海精科儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預處理 新鮮蒲公英洗凈，80 ℃條件下烘12 h，粉碎，過80目篩，置干燥箱備用。

1.2.2 總黃酮的提取工藝流程

蒲公英干粉→加入不同體積分數的乙醇溶液→加入酶在不同酶解條件下(加酶量、pH值、料液比、酶解時間、酶解溫度)進行酶解處理→水浴震蕩浸提→超聲波提取(40 ℃、100 W、0.5 h)[12]→沸水浴滅酶5 min→離心取上清液

1.2.3 單因素試驗

(1) 加酶量：參考張勝幫等[13-14]的方法，并稍作修改。準確稱取蒲公英干粉1.000 g放入三角瓶中，以50%乙醇溶液為溶劑，料液比為1∶25 (g/mL)，在pH 5.0的情況下，添加不同含量的纖維素酶和果膠酶(添加量見表1)，并在50 ℃水浴振蕩下酶解1.5 h，再經超聲溫度40 ℃、功率100 W處理0.5 h后，沸水浴滅酶5 min，離心取上清液，測定加酶量對總黃酮得率的影響。

(2) 料液比：準確稱取蒲公英干粉1.000 g放入三角瓶中，以50%乙醇溶液為溶劑，分別在料液比為1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40 (g/mL)，pH 5.0的情況下，添加纖維素酶2 mg、果膠酶4 mg，并在50 ℃水浴振蕩下酶解1.5 h，再經超聲溫度40 ℃、功率100 W處理0.5 h后，沸水浴滅酶5 min，離心取上清液，測定料液比對總黃酮得率的影響。

(3) 乙醇濃度：準確稱取蒲公英干粉1.000 g放入三角瓶中，分別以40%，50%，60%，70%，80%乙醇溶液為溶劑，料液比為1∶20 (g/mL)，在pH 5.0的情況下，添加纖維素酶2 mg和果膠酶4 mg，并在50 ℃水浴振蕩下酶解1.5 h，再經超聲溫度40 ℃、功率100 W處理0.5 h后，沸水浴滅酶5 min，離心取上清液，測定乙醇濃度對總黃酮得率的影響。

(5) 酶解溫度：準確稱取蒲公英干粉1.000 g放入三角瓶中，以50%乙醇溶液為溶劑，料液比為1∶20 (g/mL)，在pH 5.0的情況下，添加纖維素酶2 mg、果膠酶4 mg，分別在30，35，40，45，50，55 ℃水浴振蕩下酶解1.5 h，再經超聲溫度40 ℃、功率100 W處理0.5 h后，沸水浴滅酶5 min，離心取上清液，測定酶解溫度對總黃酮得率的影響。

(6) 酶解時間：準確稱取蒲公英干粉1.000 g放入三角瓶中，以50%乙醇溶液為溶劑，料液比為1∶20 (g/mL)，在pH 5.0的情況下，添加纖維素酶2 mg、果膠酶4 mg，分別在50 ℃水浴振蕩下酶解1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h，再經超聲溫度40 ℃、功率100 W處理0.5 h后，沸水浴滅酶5 min，離心取上清液，測定酶解時間對總黃酮得率的影響。

1.2.4 Design-Expert 響應面試驗 在單因素試驗基礎上，運用 Design-Expert 軟件，根據 Box-Behnken 中心組合試驗設計原理[15]，選擇4個因素作為自變量，以提取液中黃酮得率為響應值設計響應面試驗。

1.2.5 蘆丁標準曲線的繪制 取蘆丁標準品分別制得質量濃度為0.30，0.60，0.90，1.2，1.5，1.8 mg/mL的蘆丁標準溶液，分別取1 mL于10 mL容量瓶中，加入50%乙醇溶液4 mL，再加入5%的NaNO2溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min，加入10%的Al(NO3)3溶液0.4 mL，搖勻，再靜置6 min后加入4%的NaOH溶液4 mL，用50%的乙醇溶液定容，搖勻，15 min后在510 nm處測吸光度。以50%乙醇溶液為空白，對不同蘆丁質量濃度X(mg/mL)和對應吸光度Y作圖，線性回歸得到蘆丁標準曲線，其回歸方程為Y=1.132 7X+0.005 4，R2=0.999 6。

1.2.6 蒲公英總黃酮的測定 根據文獻[16]，修改如下：取試驗提取的總黃酮1 mL于10 mL容量瓶中，按照1.2.5方法測定，并按式(1)計算蒲公英總黃酮得率。

(1)

式中：

A——蒲公英總黃酮得率，mg/g；

C——總黃酮質量濃度，mg/mL；

V——溶液體積，mL；

N——稀釋倍數；

M——原料質量，g。

2016—2017年在襄陽市襄州區古驛鎮張羅崗原種場、隨州市隨縣農業科學研究所進行生產試驗，表現分蘗力強、穗多、穗大、穗層整齊，抗倒性好，綜合抗病性較好，每公頃產量分別為7680、7005kg／hm2。

1.2.7 蒲公英總黃酮抗氧化活性的研究

(1) DPPH·清除能力測定：分別配制質量濃度為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL的蒲公英總黃酮和Vc溶液。同時用無水乙醇配制質量濃度為0.1 mmol/L的DPPH溶液，置于棕色瓶備用。準確吸取不同質量濃度的總黃酮溶液1 mL于試管中，并加入3 mL的DPPH溶液，充分混合，置于暗處反應30 min，在波長510 nm處測定吸光度。同時以等濃度的Vc溶液作為陽性對照。平行測定3次[17]。按式(2)計算DPPH·清除率。

(2)

式中：

K——清除率，%；

Ai——樣品溶液的吸光度；

Aj——未添加DPPH溶液的吸光度；

A0——未添加樣品溶液的吸光度。

(2) 總還原力的測定：在試管中分別加入2.5 mL pH為6.6的PBS溶液，再加入0.01 g/mL的鐵氰化鉀溶液1 mL，混勻后，加入蒲公英總黃酮1 mL，充分搖勻，50 ℃水浴靜置20 min，待冷卻后迅速加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL混勻，吸取2 mL于另一試管中，加入0.1 g/mL三氯化鐵溶液1 mL 混勻，靜置10 min后于波長700 nm處測定吸光度。同時以VC為對照，平行測定3次[17]。

1.3 數據處理

數據通過Excel 2010進行相關計算處理，作圖利用OriginPro 8.6進行處理。

2 結果與分析

2.1 復合酶酶法提取蒲公英總黃酮的單因素試驗

2.1.1 加酶量對總黃酮得率的影響 由表1可知，加酶種類與加酶量不同會導致蒲公英總黃酮得率的不同，當纖維素酶添加量為2 mg/g、果膠酶添加量為4 mg/g時，蒲公英總黃酮得率達到最大值(9.50 mg/g)；但當纖維素酶添加量為4 mg/g、果膠酶添加量為4 mg/g時，蒲公英總黃酮得率變小。從表1還可以看出，復合酶比單獨酶作用提取的總黃酮得率高，因此選第5組加酶量較合適。

表1 加酶量對蒲公英總黃酮得率的影響Table 1 Effect of Enzyme Amount on the Yield of Total Flavonoids in Dandelion mg/g

2.1.2 料液比對總黃酮得率的影響 由圖1可知，在料液比為1∶20 (g/mL)時蒲公英總黃酮得率達到最大值(12.65 mg/g)，之后呈下降趨勢。綜合考慮，選擇料液比1∶15，1∶20，1∶25 (g/mL)作響應面分析。

2.1.3 乙醇濃度對總黃酮得率的影響 由圖2可知，當乙醇濃度<50%時，隨著乙醇濃度的增大，蒲公英總黃酮得率呈現上升趨勢；在乙醇濃度為50%時，蒲公英總黃酮得率達到最大；此后，隨著乙醇濃度的增大，總黃酮得率逐漸減小。綜合考慮，選擇乙醇濃度為40%，50%，60%作響應面分析。

圖1 料液比對蒲公英總黃酮得率的影響Figure 1 Effect of solid-liquid ratio on the yield of total flavonoids

圖2 乙醇濃度對蒲公英總黃酮得率的影響Figure 2 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids

2.1.4 pH值對蒲公英總黃酮得率的影響 由圖3可知，pH在3.0～4.5時，隨著pH值的增大，蒲公英總黃酮得率呈現上升趨勢；在pH值為4.5時，蒲公英總黃酮得率達到最大值(12.34 mg/g)；當pH值>4.5時，蒲公英總黃酮得率呈現下降趨勢。而纖維素酶的最適pH值為4.0～5.5，果膠酶的最適pH為2.5～6.0[13]。綜合考慮，選擇pH值4.0，4.5，5.0作響應面分析。

2.1.5 酶解溫度對總黃酮得率的影響 由圖4可知，當酶解溫度在40～50 ℃時，蒲公英總黃酮得率隨著溫度的升高呈上升趨勢，并在50 ℃達到最大值(11.88 mg/g)。此后，蒲公英總黃酮得率逐漸下降。綜合考慮，選擇酶解溫度45，50，55 ℃ 作響應面分析。

圖3 pH值對蒲公英總黃酮得率的影響Figure 3 Effect of pH on the yield of total flavonoids

圖4 酶解溫度對蒲公英總黃酮得率的影響Figure 4 Effect of enzyme hydrolysis temperature on the yield of total flavonoids

2.1.6 酶解時間對總黃酮得率的影響 由圖5可知，在酶解時間1.0～2.0 h時，蒲公英總黃酮得率隨著時間的延長呈上升趨勢，當酶解時間超過1.5 h之后總黃酮得率幾乎保持不變。綜合考慮，選擇酶解時間1.5 h較合適。

圖5 酶解時間對蒲公英總黃酮得率的影響Figure 5 Effect of enzyme hydrolysis time on the yield of total flavonoids

2.2 響應面試驗設計及結果

在單因素試驗基礎上，運用 Design-Expert 軟件，選擇料液比、乙醇濃度、pH值和酶解溫度4個因素作為自變量(表2)，以提取液中黃酮得率為響應值設計響應面試驗，見表3。

通過Design-Expert 8.0.6軟件對表3數據進行分析，結果見表4。由表4可知：料液比(P<0.01)、乙醇濃度(P<0.05)、酶解溫度(P<0.05)對蒲公英總黃酮得率影響顯著。經回歸擬合后，得到回歸方程：

表2 因素水平表Table 2 Factors level table

Y=14.66+1.19A+0.59B-0.18C+0.49D-0.41AB-0.093AC+0.22AD+0.83BC-0.047BD+0.023CD-1.35A2-1.11B2-1.65C2-2.94D2。

(3)

表4還表明，該模型的P<0.000 1，說明該擬合模型為極顯著。模型中A、A2、B2、C2、D2均為差異極顯著影響因素(P<0.01)；B、D為差異顯著影響因素(P<0.05)。失擬項(P=0.107 2)較小，表明該方程對試驗擬合程度好，誤差小，因此該模型成立[18]，可用該回歸方程確定蒲公英中總黃酮的最佳提取工藝。由F值可知，各因素對蒲公英總黃酮得率影響的大小順序依次為：料液比>乙醇濃度>酶解溫度>pH值。

通過 Design-Expert 8.0.6軟件分析，確定了蒲公英總黃酮的最佳提取工藝為料液比1∶22.12 (mg/mL)、pH 4.5、乙醇濃度51.78%、酶解溫度50.59 ℃，在此條件下的理論得率為14.99 mg/g。再基于設備的限制條件將響應面模型預測的最優條件修改為料液比1∶22 (mg/mL)、pH 4.5、乙醇濃度52%、酶解溫度51 ℃。

表4 響應面回歸模型方差分析?Table 4 Response surface regression model variance analysis

? * 表示差異顯著，P<0.05；** 表示差異極顯著，P<0.01。

經3次平行實驗得出，最佳提取工藝條件下蒲公英總黃酮平均得率為15.09 mg/g(n=3，RSD=0.021 6)。與理論預測值相比，其相對誤差約為0.66%，重復性較好，說明優化結果可靠。因此，蒲公英總黃酮的最佳提取工藝為6 mg/g復合酶(2 mg/g纖維素酶+4 mg/g果膠酶)、料液比1∶22(g/mL)、pH 4.5、酶解時間1.5 h、乙醇濃度52%、酶解溫度51 ℃。

2.3 蒲公英總黃酮抗氧化能力分析

2.3.1 對DPPH自由基的清除效果 由圖6可知，隨著樣品質量濃度的增加，蒲公英總黃酮對DPPH自由基的清除作用逐漸增大，從0.2 mg/mL到1.0 mg/mL，蒲公英總黃酮對DPPH自由基的清除率從55.4%增加到68.3%，而在相同質量濃度時，VC對DPPH自由基的清除率從90.8%增加到93.2%，但與沙蔥相比，同質量濃度0.4 mg/mL下，沙蔥總黃酮對DPPH自由基清除率為38%[16]，而蒲公英總黃酮對DPPH自由基清除率為60.2%，是沙蔥的1.5倍，因此，相對于VC，蒲公英總黃酮對DPPH自由基的清除能力要低于VC，但蒲公英總黃酮對DPPH自由基的清除能力大于沙蔥總黃酮，因此說明蒲公英總黃酮具有良好的DPPH自由基清除能力。

2.3.2 還原力試驗 通過還原能力的測定，可以檢測樣品是否為良好的電子供體。還原能力強的樣品可以提供更多的電子，其供應的電子不僅能使Fe3+還原為Fe2+，而且可以參與自由基的反應，使自由基形成穩定的狀態。吸光度值越高表明還原力越強[19]。由圖7可知，蒲公英總黃酮的還原能力較好，0.2～0.6 mg/mL濃度范圍時，其吸光值幾乎呈線性增長，濃度超過0.6 mg/mL后，吸光值增大速度減慢，說明蒲公英總黃酮的還原力與其質量濃度存在一定的線性關系。與VC相比，蒲公英總黃酮的還原能力稍弱，但與沙蔥總黃酮相比，同質量濃度1.0 mg/mL下，沙蔥總黃酮的吸光值為0.5[16]，而蒲公英總黃酮的吸光值為0.57，略高于沙蔥，說明蒲公英總黃酮具有良好的還原能力。

圖7 樣品與Vc還原能力比較Figure 7 Sample and Vc reduction capacity compared

3 結論

本試驗采用四因素三水平響應面分析法對復合酶酶法提取蒲公英總黃酮進行優化，得到復合酶酶法的最優提取工藝條件為料液比1∶22 (g/mL)、乙醇濃度52%、pH 4.5、酶解溫度51 ℃，在此條件下蒲公英總黃酮得率為15.09 mg/g，與樊友[10]采用微波提取蒲公英總黃酮相比得率要高，可能原因是在復合酶的共同作用下將細胞壁或細胞膜破壞，而且酶解法較溫和，會加速蒲公英中黃酮類化合物的釋放。說明復合酶酶法提取蒲公英總黃酮要比微波輔助法好。通過蒲公英總黃酮對DPPH自由基清除能力和總還原能力檢測，發現其質量濃度和抗氧化性具有一致性，試驗結果與袁河[9]54的趨勢相同。

酶提取法簡單高效，但與其他方法相比，初始投入過高、溫度要求更嚴格成為限制其工業化應用的主要因素，如何在同等效率下有效降低成本成為酶解法提取活性成分的首要問題，還有待于進一步研究。

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