大孔樹脂純化烏飯樹葉黃酮工藝研究

張德謹

陳義勇3

胡雅琳1

劉 祥1

(1.宿州學院化學化工學院，安徽 宿州 234000；2.宿州學院精細化工產品開發研究所，安徽 宿州 234000；3.常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇 蘇州 215500)

烏飯樹古稱染菽，屬于杜鵑花科[1]。作為烏飯樹葉中的功能性成分之一，黃酮類化合物具有多種生理活性，如抗氧化[2-4]、抑菌[5-7]、抗疲勞[8]等。目前，中國對烏飯樹葉資源的利用率較低，基于烏飯樹葉黃酮的生理活性，很有必要對烏飯樹葉黃酮進行純化，進而提高烏飯樹葉黃酮的附加值。目前，常用的純化方法包括柱色譜、萃取、高效液相色譜、高速逆流色譜等，相比較而言，柱色譜法具有成本低、操作程序簡單等特點[9]。其中，大孔樹脂被廣泛地應用于黃酮的分離純化[10-12]。大孔樹脂具有多孔性和較大的比表面積，主要通過物理作用從溶液中有選擇性地吸附有機物質，從而達到分離純化的目的[13]。另外，大孔樹脂具有化學穩定性好、價格便宜、易于工業化等特點，也促使了大孔樹脂在天然產物有效成分純化方面的應用越來越多。因此，本試驗選擇大孔樹脂用于烏飯樹葉黃酮的初步純化。

目前，對于烏飯樹葉黃酮的研究主要集中在如何高效提取黃酮類化合物[14-15]，以及烏飯樹葉黃酮粗提物的功能特性[16-17]等方面，對于如何利用大孔樹脂對烏飯樹葉黃酮粗提物進行純化缺乏系統性的研究，而且一些對烏飯樹葉黃酮純化方法的研究中存在黃酮純度低、工藝復雜以及溶劑有毒性等問題，影響了烏飯樹資源的開發利用。本試驗通過對大孔樹脂純化烏飯樹葉黃酮工藝的研究，確定烏飯樹葉黃酮純化工藝，并利用多種方法對純化效果進行評價，旨在為烏飯樹資源的開發利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮烏飯樹葉：產地江蘇宜興；

牛血清白蛋白：上海艾研生物科技有限公司；

槲皮素標準品：純度>98%，貴州迪大生物科技有限公司；

葡萄糖：分析純，江蘇強盛功能化學股份有限公司；

考馬斯亮藍G-250：上海譜振生物科技有限公司；

甲醇：色譜純，天津君博化工有限公司；

大孔樹脂SP-825、NKA-II、HZ-841、HZ-802：上海藍季科技發展有限公司，4種大孔樹脂理化性能見表1。

表1 樹脂的理化性能Table 1 Physical and chemical properties of resins

1.2 主要儀器

高效液相色譜儀：LC-20AD型，日本島津公司；

電熱恒溫鼓風干燥箱：DHG-9030A型，上海三發科學儀器有限公司；

數顯恒溫水浴鍋：HH-2型，金壇市接瑞爾電器有限公司；

旋轉蒸發儀：RE-52A型，上海亞榮生化儀器廠；

循環水式多用真空泵：SHB-B95型，鄭州長城科工貿有限公司；

可見分光光度計：722型，上海菁華科技儀器有限公司；

恒溫振蕩器：THZ-A型，上海五相儀器儀表有限公司；

真空干燥箱：DZF-6050型，上海邁捷實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 烏飯樹葉黃酮的制備 取粉碎后的烏飯樹葉粉末20 g 置于1 000 mL燒杯中，加入800 mL蒸餾水，50 ℃下浸提2 h，經濃縮后得到烏飯樹黃酮[17]。

1.3.2 黃酮濃度的測定 分別移取0.0，0.4，0.8，1.6，2.0，2.4，2.8，3.2 mL 50 mg/L標準液至10 mL容量瓶中，用1% AlCl3定容，在434 nm處測定各標準液的吸光度，得到擬合曲線方程為：A=0.064 7C+0.004 08，線性范圍為2～14 mg/L，R2=0.999 75。

1.3.3 樹脂的預處理 參照文獻[18～19]，將大孔樹脂SP-825、NKA-II、HZ-841和HZ-802先后用乙醇、鹽酸以及氫氧化鈉進行處理，最后用蒸餾水洗至中性。

1.3.4 吸附樹脂的選擇

(1) 樹脂的吸附與解吸性能比較：分別稱取預處理的大孔樹脂SP-825、NKA-II、HZ-841、HZ-802各1 g (干重)，各加入30 mL烏飯樹黃酮溶液(濃度為0.55 mg/mL)中，然后放到溫度為25 ℃的恒溫振蕩器中，以120 r/min振蕩12 h，按式(1)、(2)計算樹脂的吸附容量與吸附率。

(1)

(2)

式中：

Qe——吸附容量，mg/g；

E——吸附率，%；

C0——液相中黃酮的初始濃度，mg/mL；

Ce——達到吸附平衡時的黃酮濃度，mg/mL；

Vi——樣品溶液體積，mL；

W——樹脂的質量，g。

將吸附飽和的樹脂用蒸餾水洗凈，加入30 mL 體積分數為50%的乙醇，在25 ℃下以120 r/min振蕩12 h，按式(3)計算樹脂的解吸率。

(3)

式中：

D——解吸率，%；

Cd——液相中黃酮濃度，mg/mL；

Vd——洗脫液體積，mL。

(2) 靜態吸附動力學曲線：準確稱取1 g預處理后的大孔樹脂，加入濃度為0.5 mg/mL的烏飯樹黃酮溶液30 mL，在25 ℃下以120 r/min轉速恒溫振蕩，至吸附達到平衡前，每隔一定時間測定液相中黃酮的濃度，計算各個時間的吸附量。

1.3.5 烏飯樹葉黃酮純化工藝

(1) 上樣濃度對吸附率的影響：準確稱取1 g預處理后的大孔樹脂，裝入層析柱中(柱體積為14 mL)，分別用黃酮濃度為0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.50 mg/mL的烏飯樹葉黃酮溶液上樣，上樣流速1 mL/min，上樣體積30 mL，考察不同上樣濃度對吸附率的影響。

(2) 動態穿透曲線：準確稱取1 g預處理后的大孔樹脂，裝入層析柱中(內徑3 cm)，烏飯樹葉黃酮溶液上樣濃度0.75 mg/mL，上樣流速1 mL/min，用自動收集器收集流出液，每管收集3.5 mL，測定收集管中黃酮的濃度，繪制動態穿透曲線。

(3) 乙醇體積分數對解吸率的影響：按照1.3.5(2)中的上樣條件進行上樣，用蒸餾水洗脫至洗脫液無色，再分別用10%，30%，50%，70%，90%(體積分數)的乙醇溶液以1 mL/min 洗脫流速洗脫，比較不同體積分數的乙醇對解吸率的影響。

(4) 洗脫流速對解吸率的影響：按照1.3.5(2)中的上樣條件進行上樣，上樣結束后，先用蒸餾水洗脫至洗脫液無色，然后用50%(體積分數)的乙醇溶液洗脫，洗脫流速分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL/min，比較不同洗脫流速對解吸率的影響。

(5) 動態解吸曲線：在確定的最佳工藝條件下上樣，上樣結束后先用蒸餾水洗脫至洗脫液為無色，然后用50%(體積分數)的乙醇溶液以1 mL/min的流速進行洗脫，用自動收集器收集洗脫液，測定洗脫液中的黃酮濃度，繪制動態解吸曲線。

1.3.6 純化效果評價

(1) 多糖含量及脫除率的計算：參見文獻[20]，以葡萄糖作為標準物制作標準曲線，得到的線性方程為：A=0.008 6C+0.033 2，R2=0.993 5。按式(4)、(5)計算純化前后多糖含量及多糖脫除率。

(4)

(5)

式中：

w1——多糖含量，%；

R1——多糖脫除率，%；

c1——多糖濃度，mg/mL；

v——樣品溶液體積，mL；

m——固形物質量，mg；

m1——純化前多糖質量，mg；

m2——純化后多糖質量，mg。

(2) 蛋白質含量及脫除率的計算：參見文獻[21]，采用考馬斯亮藍法測定烏飯樹葉提取物中的蛋白質含量。線性回歸方程為：A=0.002 0C-0.002 0，R2=0.999 1。按式(6)、(7)計算蛋白質脫除率。

(6)

(7)

式中：

w2——蛋白質含量，%；

R2——蛋白質脫除率，%；

c2——蛋白質濃度，mg/mL；

m3——純化前蛋白質質量，mg；

m4——純化后蛋白質質量，mg。

(3) 黃酮純度的計算：根據1.3.2中黃酮的定量方法，計算純化前后黃酮純度，按式(8)計算黃酮純度。

(8)

式中：

P——黃酮純度，%；

c3——黃酮濃度，mg/mL。

(4) 純化前后烏飯樹葉黃酮HPLC譜圖的比較：純化前與純化后的烏飯樹黃酮溶液用0.22 μm的微孔膜過濾，進行HPLC分析。HPLC分析條件：紫外檢測器；檢測波長為370 nm；色譜柱VP-ODS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇∶水=0.44∶0.36(體積比)；柱溫30 ℃；流速0.8 mL/min；進樣量5 μL；時間30 min。

2 結果與討論

2.1 吸附樹脂的選擇

2.1.1 樹脂的吸附與解吸比較 樹脂的吸附和解吸性能與吸附劑的結構以及被吸附物的化學性質都有一定的關系[22]。由圖1可知，4種樹脂中，SP-825和NKA-II的吸附率與吸附量相對較高，這是由于SP-825和NKA-II2種樹脂極性與烏飯樹葉中黃酮類化合物極性較為接近，較易發生吸附行為。因此選擇SP-825和NKA-II 2種樹脂進行進一步的性能比較。

圖1 靜態吸附與解吸試驗結果Figure 1 Results of static adsorption and desorption experiment

2.1.2 靜態吸附動力學曲線 由圖2可知，NKA-II樹脂在3 h達到吸附平衡，SP-825樹脂在4 h達到吸附平衡，并且NKA-II樹脂對烏飯樹葉黃酮的最大吸附量大于SP-825樹脂的。因此選擇大孔樹脂NKA-II用于烏飯樹葉黃酮的初步純化。

2.2 烏飯樹葉黃酮純化工藝的確定

2.2.1 上樣濃度對吸附率的影響 由圖3可知，隨著上樣濃度的增大，黃酮的吸附量增加，但同時黃酮的吸附率卻下降。這是由于大孔樹脂本身吸附位點是一定的，隨著上樣濃度的提高，大孔樹脂吸附位點接近飽和，致使黃酮損失嚴重，此外，隨著上樣濃度的增大，與黃酮發生競爭吸附的雜質濃度同樣增大，影響了大孔樹脂對烏飯樹葉黃酮的吸附過程。考慮到高效地利用烏飯樹葉黃酮，選擇上樣濃度為0.75 mg/mL。

圖2 靜態吸附動力學曲線Figure 2 Static adsorption kinetics curves

圖3 上樣濃度對吸附效果的影響Figure 3 Effect of initial concentration of flavones on adsorption

2.2.2 動態穿透曲線 穿透曲線是工業上吸附過程設計和操作的基礎，由圖4可知，當上樣體積為2.0 BV時，流出液濃度基本穩定，說明吸附過程基本趨于平衡。因此確定合適的上樣體積為2.0 BV。

圖4 動態穿透曲線Figure 4 Dynamic breakthrough curve

2.2.3 乙醇體積分數對解吸率的影響 大孔樹脂吸附烏飯樹葉黃酮后，選擇洗脫劑時主要考慮其極性對洗脫效果的影響，NKA-II樹脂為中等極性的大孔樹脂，因此選擇中等極性溶劑洗脫。由圖5可知，隨著乙醇體積分數的增加，黃酮的解吸率也相應地增大，但是當乙醇體積分數>50%以后，解吸率變化緩慢，并且隨著乙醇體積分數的增大，洗脫溶液中醇溶性雜質不斷增加，最終導致烏飯樹葉黃酮純度下降。為了節約有機溶劑、提高純化后黃酮純度，選擇50%的乙醇作為洗脫劑。

2.2.4 洗脫流速對解吸率的影響 由圖6可知，隨著洗脫流速的增加，解吸率逐漸降低，這是因為過高的洗脫流速，致使解吸過程中溶劑與黃酮類化合物接觸時間較短，難以高效地將烏飯樹葉黃酮洗脫。考慮到洗脫流速為0.5 mL/min時洗脫時間太長，因此選擇洗脫流速為1.0 mL/min。

圖5 乙醇濃度對洗脫效果的影響Figure 5 Effect of ethanol aqueous solution on desorption

圖6 洗脫流速對洗脫效果的影響Figure 6 Effect of flow rate of elution on desorption

2.2.5 動態解吸曲線 由圖7可知，NKA-II樹脂吸附烏飯樹葉黃酮較易洗脫，在洗脫劑用量為1 BV時，洗脫濃度達到最高，洗脫峰較為集中，當洗脫劑用量達到3 BV后，烏飯樹葉黃酮基本被洗脫完。因此確定合適的洗脫體積為3 BV。

圖7 動態解吸曲線Figure 7 Dynamic desorption curve

2.3 純化效果評價

2.3.1 蛋白質、多糖脫除率以及黃酮純度變化 純化前后的烏飯樹黃酮溶液在真空條件下進行干燥，對烏飯樹黃酮溶液中的主要成分進行分析，結果見表2。由表2可知，NKA-II樹脂能夠有效脫除烏飯樹黃酮溶液中蛋白質、多糖等雜質，大大提高了烏飯樹葉黃酮純度。

2.3.2 純化前后烏飯樹葉黃酮HPLC譜圖比較 王立等[23]已經從烏飯樹葉的提取物中分離出槲皮素，因此本研究利用槲皮素作為標準對照物，考察純化前后烏飯樹葉槲皮素純度的變化。純化前后HPLC譜圖變化的結果見圖8。由圖8可知，純化后槲皮素的相對峰面積明顯提高，說明經過NKA-II樹脂的純化后，烏飯樹葉槲皮素純度明顯提高。

表2 烏飯樹葉黃酮提取物中蛋白質、多糖含量及黃酮純度Table 2 Content of protein and polysaccharide and purity of flavones from VBTL %

3 結論

大孔樹脂已經廣泛地應用于黃酮類化合物的分離純化，樹脂的結構和極性是影響其吸附性能的主要因素。本試驗中所用的大孔樹脂有極性、非極性和弱極性，通過靜態吸附與解吸性能的比較，確定NKA-II樹脂用于烏飯樹葉黃酮的純化，是由于烏飯樹葉黃酮類化合物中的酚羥基具有一定的極性，有利于極性樹脂的吸附。通過NKA-II樹脂吸附于解吸烏飯樹葉黃酮試驗，確定烏飯樹葉黃酮純化工藝條件為：上樣濃度0.75 mg/mL，上樣流速1 mL/min，上樣體積2.0 BV，洗脫流速1.0 mL/min，洗脫劑為50%(體積分數)的乙醇，洗脫體積3 BV。在該純化工藝條件下，蛋白質脫除率為76.32%，多糖脫除率為65.45%，黃酮純度達48.92%。通過純化前后HPLC譜圖的變化對純化效果進行評價，結果表明經過NKA-II樹脂純化后，烏飯樹葉提取物中槲皮素純度明顯提高。但是，純化后總黃酮含量偏低，需要后期進行進一步研究，從而達到降低純化過程中烏飯樹葉黃酮損失的目的。除此之外，通過本試驗并未得到黃酮類化合物單體，需要后期結合其他分離純化手段對烏飯樹葉黃酮進行進一步分離。

圖8 純化前后烏飯樹葉黃酮HPLC譜圖比較Figure 8 HPLC analysis of flavones from VBTL before and after purification

[1] 余清, 陳紹軍, 龐杰.烏飯樹葉有效成分的研究及其開發應用[J].食品與機械, 2007, 23(3): 171-174.

[2] 蔡凌云.烏飯樹葉中總黃酮體外抗氧化活性[J].中成藥, 2011, 33(6): 1 054-1 057.

[3] 程素嬌, 鄧璐璐, 章海燕, 等.烏飯樹樹葉多糖提取及純化工藝優化研究[J].食品與機械, 2012, 28(6): 142-146.

[4] DANIELA B, LUISA T, FRANCESCA D G, et al.Antioxidant activities of sicilian prickly pear (opuntia ficus indica) fruit extracts and reducing properties of its betalains: betanin and indicaxanthin[J].Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50(23): 6 895-6 901.

[5] 章海燕, 王立, 張暉.烏飯樹樹葉水溶性黃酮的抑菌作用的研究[J].中國食品添加劑, 2010(5): 62-67.

[6] EDZIRI H, MASTOURI M, AMMAR S, et al.Antimicrobial, antioxidant, and antiviral activities of retama raetam (forssk) webb flowers growing in Tunisia[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2008, 24(12): 2 933-2 940.

[7] GOMAH N.Antimicrobial activity of Calotropis procera Ait.(Asclepiadaceae) and isolation of four flavonoid glycosides as the active constituents[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2013, 29(7): 1 255-1 262.

[8] 黃麗娜, 馬文領, 周健, 等.烏飯樹葉醇提物抗大鼠精神疲勞作用[J].中國公共衛生, 2008, 24(8): 964-966.

[9] LIU Wei, ZHANG Su, ZU Yuan-gang, et al.Preliminary enrichment and separation of genistein and apigenin from extracts of pigeon pea roots by macroporous resins[J].Bioresource Technology, 2010, 101(12): 4 667-4 675.

[10] 邵金華, 何福林, 陳霞, 等.梓樹根皮總黃酮分離純化及其抑菌活性研究[J].食品與機械, 2017, 33(2): 140-144.

[11] LI Jie, CHEN Zhen-bin, DI Duo-long.Preparative separation and purification of Rebaudioside A from Stevia rebaudiana Bertoni crude extracts by mixed bed of macroporous adsorption resins[J].Food Chemistry, 2012, 132(1): 268-276.

[12] 劉雪輝, 張思, 張志旭, 等.大孔吸附樹脂純化薄荷總黃酮工藝優選[J].食品與機械, 2016, 32(8): 156-158.

[13] 劉火安, 賈云, 戴傳云, 等.葛根總黃酮分離純化的研究[J].生物技術通訊, 2005(5): 522-524.

[14] 陳義勇, 張德謹.烏飯樹葉黃酮超聲—微波輔助提取工藝的優化[J].食品與機械, 2016(1): 148-153.

[15] 王立, 姚惠源.烏飯樹樹葉中黃酮類色素的提取與分離純化[J].食品與發酵工業, 2004, 30(9): 120-125.

[16] 王立, 唐小舟, 姚惠源, 等.烏飯樹樹葉中黃酮類色素清除活性氧自由基的研究[J].食品科學, 2005, 26(12): 98-102.

[17] 章海燕, 王立, 張暉.基于響應面分析法優化的烏飯樹葉樹葉水溶性黃酮提取條件[J].食品工業科技, 2010, 31(2): 260-263.

[18] 劉穎, 魏元峰, 蔣偉, 等.大孔樹脂對黃芩黃酮吸附的初步研究[J].湖北中醫學院學報, 2005, 7(2): 28-30.

[19] 張靜.銀杏黃銅純化及生物活性研究[D].無錫: 江南大學, 2010: 24-25.

[20] 孟凡欣, 蔣朝軍, 于笑坤, 等.刺五加多糖的提取及含量測定[J].食品工業科技, 2005, 26(7): 110-112.

[21] 王文平, 郭祀遠, 李琳, 等.考馬斯亮藍法測定野木瓜多糖中蛋白質的含量[J].食品研究與開發, 2008, 29(1): 115-117.

[22] LIU Yong-feng, LIU Jun-xi, CHEN Xiao-fen, et al.Prepar-ative separation and purification of lycopene from tomato skins extracts by macroporous adsorption resins[J].Food Chemistry, 2010, 123(4): 1 027-1 034.

[23] 王立, 姚惠源, 陶冠軍, 等.烏飯樹樹葉中槲皮素的提取分離與鑒定[J].食品與生物技術學報, 2005, 24(4): 89-91.