氧載體對綠色產色鏈霉菌發酵生產阿維拉霉素的影響

章 梅ZHANG Mei

宋元達1,2

劉 青1,2

王友玲1,2

吳 翰1,2

(1.山東理工大學農業工程與食品科學學院，山東 淄博 255000；2.山東省高校農產品功能化技術重點實驗室，山東 淄博 255000)

阿維拉霉素又名肥拉霉素，是一種正糖霉素族的寡糖類抗生素，具有調節動物腸內細菌代謝[1-2]和促進動物生長的作用[3]。阿維拉霉素對革蘭氏陽性菌具有較好的抑制效果，對大腸桿菌有著間接的影響，能有效地減小動物的感染率[4]，還可以促進動物生長、提高飼料回報率同時具有低殘留和低毒性、無交叉耐藥性等優點，已經作為一種飼料添加劑用于豬和肉雞的養殖[5-6]。

阿維拉霉素的生產是好氧發酵過程，發酵液中溶氧水平的高低與細胞內酶的活性有著直接的關系，決定了何種代謝途徑生成 ATP、還原力及各種代謝物[7]；對細胞的生長和細胞內阿維拉霉素的合成有重大影響。為了滿足發酵過程中氧的要求，常用攪拌轉速和增大通氣量等方法來提高發酵液中溶氧水平，但過大的剪切力會引起菌絲損傷，造成菌絲斷裂、泡沫增多和變大以及發酵不易控制等[8]。也有學者利用轉基因技術將透明顫菌血紅蛋白的基因克隆到目的菌株，降低菌株對氧的敏感度，使菌株適應發酵液中較低的溶氧水平，提高對氧的利用[9]；向發酵液中加入過氧化氫等[10]分子氧底物。以上2種方法存在基因的表達不穩定或丟失[11]和本身有著較大毒性等[12]問題。通過添加氧載體來改善發酵液的溶氧水平，也能提高發酵產量[13]。

氧載體是一種對細胞沒有毒性，具有比水更高的溶氧能力的有機化合物[14]。在發酵液中添加正己烷、煤油和表面活性劑等氧載體，引入新的液相，減小氣液之間的傳氧阻力，提高Kla(傳氧系數)值，在同一發酵系統中能提高30%～300%，或達到同樣混合效果時降低攪拌功率 30% 以上[15]。目前國內外尚未發現有氧載體用于發酵生產阿維拉霉素的研究。本試驗擬研究各種氧載體對綠色產色鏈霉菌產阿維拉霉素的影響，進一步觀察其發酵參數，對氧載體的效果進行評價和篩選，并考察添加時間和濃度對生物量及阿維拉霉素合成的影響，以期為氧載體在阿維拉霉素工業化生產的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

綠色產色鏈霉菌(S.viridochromogene LY013)：浙江凌云藥業有限公司。

1.2 主要儀器和試劑

1.2.1 主要試劑

Avilamycin標準品：80%，美國歷來公司；

吐溫20、吐溫80：分析純，上海滬試劑廠；

正己烷：分析純，上海沃凱生物技術有限公司。

1.2.2 主要儀器

超凈工作臺：ZHJH-C1115C型，上海智城分析儀器制造有限公司；

隔水式恒溫培養箱：GRP-9160型，上海森信儀器有限公司；

液相色譜儀：waters600e型，沃特世科技(上海)有限公司。

1.3 培養基與培養方法

1.3.1 培養基

斜面培養基：可溶性淀粉20.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KNO31.0 g/L、FeSO4·7H2O 0.5 g/L、NaCl 0.5 g/L、瓊脂 20.0 g/L，pH 7.2～7.4；

種子培養基：豆餅粉 32 g/L、甘露醇 22 g/L、蛋白胨 5 g/L、葡萄糖 10 g/L、NaCl 5 g/L、(NH4)2SO4、6.4 g/L、MgSO40.05 g/L，pH 7.2～7.4；

發酵培養基：甘露醇 25 g/L、豆餅粉 34 g/L、可溶性淀粉 6.4 g/L、(NH4)2SO42.5 g/L、葡萄糖 2 g/L、MgSO40.05 g/L、CaCO35 g/L，pH 7.2～7.4。

1.3.2 培養方法

液體種子培養：挑選斜面培養基中長勢較好的綠色產色鏈霉菌的孢子，接種于裝有50 mL種子培養基的250 mL 三角瓶內。在28 ℃的搖床里以 200 r/min 振蕩培養 24 h；

液體發酵培養：以 6%的接種量，將已培養種子培養液接入到裝有50 mL 發酵培養基的250 mL三角瓶中，在28 ℃ 條件下200 r/min 振蕩培養72 h。

1.4 分析方法

1.4.1 樣品處理 取5.0 mL發酵液于離心管中，4 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入9.0 mL無水甲醇，用振蕩器充分振蕩后，浸提30 min，用濾膜過濾，經無水甲醇稀釋的上清液即為待測液。

1.4.2 菌體生物量的測定 在發酵48 h后，吸取發酵液10 mL，4 000 r/min離心10 min，倒出上清液，沉淀物烘干至恒重的質量即為菌體生物量。

1.4.3 還原糖的測定 采用DNS法[16]。

1.4.4 阿維拉霉素的測定 取1 mL的發酵液移至裝有3 mL 甲醇的5 mL的離心管中，旋渦震蕩3 min，超聲10 min 后經0.22 μm過濾膜過濾，搖勻，備用。

采用高效液相色譜分析(HPLC)法。色譜條件：流動相為乙腈∶0.2%磷酸二氫銨=51∶49(體積比)；流速1 mL/min；色譜柱Agilent C18，4.6 mm×250 mm；檢測波長214 nm，柱溫35 ℃，進樣量20.0 μL。

1.4.5 得率系數的計算 按式(1)計算得率系數。

(1)

式中：

R——得率系數，mg/g；

M——阿維拉霉素，mg/L；

DCW——生物量，g/L。

2 結果與分析

2.1 氧載體對阿維拉霉素的影響

選擇7種常用氧載體以2 g/L的添加量進行綠色產色鏈霉菌發酵試驗，結果見圖1。由圖1可知，添加氧載體均可以提高阿維拉霉素的產量。其中吐溫20、吐溫80、正己烷的效果明顯；其余的氧載體也有一定的促進作用，但與前3組比較，效果不顯著。與對照組相比，正己烷提高了21 mg/L，吐溫 20提高了26 mg/L，吐溫80的促進效果最好，增加了40 mg/L。顯然吐溫對阿維拉霉素的合成具有較好的促進效果，從促進效果和經濟性角度綜合考慮，選擇正己烷、吐溫20和吐溫80作為研究對象，進一步研究其對阿維拉霉素產量的促進作用。

圖1 氧載體對阿維拉霉素產量的影響Figure 1 Effect of different oxygen-vectors on the yield of avilamycin

2.2 氧載體添加量對發酵的影響

2.2.1 吐溫20、吐溫80和正己烷添加量對阿維拉霉素產量的影響 由圖2可知，添加量低于3 g/L時，隨著氧載體添加量的增加，阿維拉霉素產量也隨著增加。添加量為3 g/L時，阿維拉霉素產量均達到最高。吐溫80的提升效果要優于吐溫20與正己烷的。當添加量超過3 g/L時，阿維拉霉素產量均有所減小，說明過高濃度的氧載體對菌生產阿維拉霉素不利，可能是氧的濃度對抗生素的產量影響降低。其中添加量為3～4 g/L時正己烷組產量下降較快，可能是高濃度的正己烷影響了阿維拉霉素相關酶系導致產量下降[17]。高濃度的氧載體能提高Kla系數[18]，提高發酵液的溶氧水平，促進阿維拉霉素產量的提高，但是過高濃度氧載體卻不利于綠色產色鏈霉菌的發酵，使得發酵液中阿維拉霉素含量降低。

2.2.2 吐溫20、吐溫80和正己烷添加量對生物量的影響

圖3顯示，在添加量為3 g/L時菌體量達到最大值，添加正己烷、吐溫80和吐溫20的發酵液生物量與對照組生物量(9.80 g/L)相比，分別提高了15.58%，20.63%，16.58%。與正己烷組相比，吐溫80對生物量促進的效果更為明顯。

圖2 正己烷、吐溫20和吐溫80添加量對阿維拉霉素產量的影響Figure 2 Effect of different n-hexane, Tween-20 and Tween-80 concentration on the yield of avilamycin

圖3 正己烷、吐溫20和吐溫80添加量對生物量的影響Figure 3 Effect of different n-hexane, Tween-20 and Tween-80 concentration on dry weight of cells

這可能是吐溫80本身就可以作為營養源，供給微生物生長，而且吐溫可以增大細胞的通透性，使細胞的新陳代謝較為容易[19]，從而促進了細胞的生長，提高了生物量。同時發現添加量超過3 g/L時，正己烷、吐溫20和吐溫80組的生物量都有所降低。其中正己烷組的生物量下降速度較快，可能是由于高濃度烷烴類氧載體對菌體的傷害較強，使得菌絲體在發酵后期快速降解[20]，與馮杰等[21]研究結果相符。說明氧載體的濃度過高不利于菌體量的增長，同時會干擾微生物的發酵，抑制菌體合成次生代謝產物的能力，造成單位菌體產阿維拉霉素能力下降。

2.2.3 吐溫20、吐溫80和正己烷添加量對得率系數的影響

由圖4可知，添加不同氧載體的發酵液中得率系數的趨勢大致相同，添加0～2 g/L時隨著氧載體濃度的提高，正己烷、吐溫20和吐溫80組的菌體得率系數逐漸增大，說明低濃度氧載體均有利于單位細胞產阿維拉霉素的能力提高。比較圖2～4的數據可知，添加量為2～3 g/L時，添加氧載體能促進阿維拉霉素的產量和生物量的提高，與顏日明等[22]的研究結果相同，但阿維拉霉素的得率系數基本維持不變甚至有所降低，說明產量的增加與生物量的提高有很大關系，不僅僅是單位細胞產率增大的結果。添加量超過3 g/L 時，3種氧載體的得率系數、生物量和產量都沒有提高，甚至有所降低。這可能是菌體在生長階段和代謝階段受到的限制主要因素不僅僅是氧濃度，還受到發酵本身的碳源和氮源限制。

圖4 正己烷、吐溫20和吐溫80添加量對得率系數的影響Figure 4 Effect of n-hexane, Tween-20 and Tween-80 concentration on dry weight of cells and the yield of avilamycin

2.3 吐溫20、吐溫80和正己烷添加時間對阿維拉霉素產量的影響

在上述試驗的基礎上，以3 g/L的添加量進一步研究氧載體在發酵過程中的添加時間對阿維拉霉素產量的影響，結果見圖5。由圖5可知，發酵后24 h內添加氧載體比發酵開始時添加能顯著提高阿維拉霉素產量；前8 h，隨著添加時間的推遲，阿維拉霉素的產量整體呈上升趨勢，提示氧載體最適的添加時間為鏈霉菌的對數生長期，可能是菌體在對數生長期對氧的要求較高，添加氧載體解除溶氧極限，有利于菌體的生長；而在發酵后期(24 h后)添加氧載體，隨著添加時間推遲，阿維拉霉素的產量低于發酵初始添加，這是因為進入生長穩定期，氧載體的添加對菌體量的促進效果減低。另外吐溫組的產量超過了正己烷組，可能是氧載體吐溫80對生物量有明顯提升效果，與王爽等[19]的研究結果一致。但是抗生素是次級代謝產物，其產量的高低受多種因素影響，菌體量只是其中的一個方面；液態烷烴在發酵液中可以起到分散劑的作用，使細胞間的絮凝性降低，較大的菌絲團在剪切力的作用下會分散成數個小菌絲團。與大菌絲團相比，分散的較小菌絲團界面面積會有所增加，從而加快了氧傳遞到菌絲體內的總速度。但是烷烴較高的毒性會抑制菌體產抗生素的能力，降低阿維霉素的產量。

圖5 正己烷、吐溫20和吐溫80添加時間對阿維拉霉素產量的影響Figure 5 Effect of n-hexane, Tween-20 and Tween-80 concentration addition time on and avilamycin production

2.4 吐溫80對阿維拉霉素發酵過程的影響

以吐溫80為氧載體，添加時間為8 h、添加量為3 g/L進行發酵試驗，其發酵過程中綠色產色鏈霉菌的生物量、產量、培養基pH值、殘糖含量的變化趨勢見圖6。由圖6可知，添加氧載體能加快菌體的生長，提高生物量，并提高了單位菌體產阿維拉霉素的能力，兩者共同作用促使阿維拉霉素產量顯著提高。在0～16 h菌體的對數生長期，發酵液中阿維拉霉素的含量較低，pH值和還原糖的含量都急劇下降；在16 h后，生物量逐漸保持穩定，菌體進入穩定期，并保持不變，而阿維拉霉素的含量呈指數上升，并在40 h達到最大值，這種發酵類型屬于非生長偶聯型發酵；同時發酵液中pH值由發酵早期的逐漸減小轉變為逐漸增大，還原糖的消耗速率也有著明顯的降低，可能與菌體在發酵過程中產生的有機酸有關[20]。葡萄糖經EMP途徑等生成的有機酸被部分排出細胞外，使得發酵液的有機酸含量增高，pH值下降，但在阿維拉霉素生產期，由于發酵液中碳源量的降低，有機酸被菌體重新利用[23-25]，pH值逐漸上升；同時菌體進入次生代謝期，生物量不再增加，還原糖的消耗速率也逐漸減小，阿維拉霉素含量也急劇上升[26]。因此在8 h發酵的對數生長期添加吐溫80解除溶氧限制，能提高生物量和阿維拉霉素的產量[27-28]。

圖6 發酵過程中pH、還原糖、生物量、阿維拉霉素的曲線圖Figure 6 The curve of pH, deoxidize sugar, Biomass, avilamycin during fermentation

3 結論

本研究將7種氧載體添加到綠色產色鏈霉菌的發酵過程中，結果顯示添加的氧載體均可以提高其阿維拉霉素的產量，其中吐溫20、正己烷和吐溫80效果最好。在此基礎上考察這3種氧載體對綠色產色鏈霉菌合成阿維拉霉素的影響，發現3種氧載體均可以提高生物量，同時能提高綠色產色鏈霉菌的得率系數，從而提高綠色產色鏈霉菌產阿維拉霉素的能力，其中吐溫80作為氧載體的效果最好。另外，還研究了氧載體添加時間對阿維拉霉素產量的影響，在發酵開始的第 8天添加 3 g/L 的吐溫80與對照組相比，生物量提高了20.63%，得率系數增加到3.12%。

本試驗證明了氧載體能強化氧傳遞速率，提高菌體的生物量和得率系數，促進代謝產物的合成。下一步將研究各種氧載體的協同作用對阿維拉霉素產量提高的影響以及對菌體糖代謝的關鍵酶活性的影響，進一步發掘氧載體的促進機制。

[1] SCHABERG D R, CULVER D H, GAYNES R P.Major trends in the microbial etiology of nosocomial infection[J].American Journal of Medicine, 1991, 91(3B): 72S.

[2] SWARTZ M N.Hospital-acquired infections: diseases with increasingly limited therapies[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91(7): 2 420-2 427.

[3] HERNANDEZ F, MADRID J, GARCIA V, et al.Influence of two plant extracts on broilers performance, digestibility, and digestive organ size[J].Poult Sci, 2004, 83(2): 169-174.

[4] PARADIS M A, MCMILLAN E, BAGG R, et al.Efficacy of avilamycin for the prevention of necrotic enteritis caused by a pathogenic strain of Clostridium perfringens in broiler chickens[J].Avian Pathology, 2016, 45(3): 365-369.

[5] AARESTRUP F M, BAGER F, ANDERSEN J S.Association between the use of avilamycin for growth promotion and the occurrence of resistance among Enterococcus faecium from broilers: epidemiological study and changes over time[J].Microbial Drug Resistance, 2000, 6(1): 71-75.

[6] 王東衛, 王瑛.飼用抗生素在雛雞生產中應用效果的比較[J].飼料工業, 2011, 32(24): 62-64.

[7] 張克旭, 陳寧, 張蓓.代謝控制發酵[M].北京: 中國輕工業出版社, 1998: 25-50.

[8] YE Rui-fang, WANG Qian, ZHOU Xiao-fang.Lincomycin, rational selection of high producing strain and improved fermentation by amino acids supplementation[J].Bioprocess and Biosystems Engineering, 2009, 32(4): 521-529.

[9] 吳益民, 王洪軍, 孫艷, 等.透明顫菌血紅蛋白基因在紅色糖多孢菌株中表達及對紅霉素產量的影響[J].中國抗生素雜志, 2007, 32(10): 599-601.

[10] 翁雪清, 施巧琴, 吳松剛.氧載體、表面活性劑及H2O2對L-phe發酵影響的研究[J].氨基酸和生物資源, 2012, 34(2): 39-42.

[11] 文瑩, 宋淵, 李季倫.透明顫菌血紅蛋白在肉桂地鏈霉菌中的表達對其細胞生長及抗生素合成的影響[J].生物工程學報, 2001, 17(1): 24-28.

[12] 李書良, 焦鵬, 曹竹安.流加H2O2對提高供氧及微生物代謝的影響[J].微生物學報, 2002, 42(1): 129-132.

[13] 崔培梧, 胡亞強, 鐘瑜萍, 等.氧載體對茯苓菌液態深層發酵的影響[J].中藥材, 2015, 38(6): 1 157-1 160.

[14] NARTA U, ROY S, KANWAR S S, et al.Improved production ofL-asparaginase by Bacillus brevis cultivated in the presence of oxygen-vectors[J].Bioresource Technology, 2011, 102(2): 2 083-2 085.

[15] WANG Jiang-long.Enhancement of citric acid production by As pergillusni gerusing n-dodecane as an oxygen-vector[J].Process Biochemistry, 2000, 35(10): 1 079-1 083.

[16] 趙凱, 許鵬舉, 谷廣燁.3,5-二硝基水楊酸比色法測定還原糖含量的研究[J].食品科學, 2008, 29(8): 534-536.

[17] XU Fang, YUAN Qi-peng, ZHU Yan.Improved production of lycopene and b-carotene by Blakeslea trispora with oxygen-vectors[J].Process Biochemistry, 2006, 42(2): 289-293.

[18] 王英燕, 張芙蓉, 田智斌.氧載體對番茄紅素發酵影響[J].藥學研究, 2014, 33(4): 196-199.

[19] 王爽, 周魏, 劉紅冉, 等.幾種氧載體對納他霉素發酵的影響[J].食品科學, 2015, 40(6): 102-107.

[20] 彭超, 黃和, 劉欣, 等.添加正十六烷對高山被孢霉發酵生產花生四烯酸的影響[J].食品科技, 2010(5): 2-5.

[21] 馮杰, 馮娜, 唐慶九, 等.氧載體正十二烷對靈芝三萜液態深層發酵的影響[J].食用菌學報, 2016, 23(2): 52-58.

[22] 顏日明, 艾佐佐, 汪涯, 等.雙液相體系強化氧傳遞促進微生物油脂生產[J].生物工程學報, 2013, 29(4): 536-539.

[23] 王衡偉, 陳長華, 付水林, 等.腺苷發酵液中有機酸的代謝規律[J].華東理工大學學報: 自然科學版, 2004, 30(2): 223-226.

[24] 諶頡, 儲炬, 莊英萍, 等.阿維菌素發酵過程有機酸積累規律與生物合成的關[J].華東理工大學學報: 自然科學版, 2005, 31(6): 731-734.

[25] LOPES D S T, REIS A.The use of multi-parameter flow cytometry to study the impact of n-dodecane additions to marine dinoflagellate microalga Crypthecodinium cohnii batch fermentations and DHA production[J].Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2008, 35(8): 875-887.

[26] 李娜娜, 吳曉英, 吳振強.液態烷烴氧載體對粘紅酵母發酵產番茄紅素的影響[J].生物技術通報, 2015, 31(2): 196-201.

[27] 劉芳, 李曉榮, 鄒祥.阿維拉霉素生物合成與代謝調控研究進展[J].生物技術通報, 2010(12): 25-30.

[28] SEIFU D G, ISIMJAN T T, MEQUANINT K.Tissue engineering scaffolds containing embedded fluorinated-zeolite oxygen vectors[J].Acta Biomaterialia, 2011, 7(10): 3 670-3 678.