EMS-ARTP復合誘變選育高產DHA裂殖壺菌

趙 犇

王 武1

李昌靈2

楊海麟1

(1.江南大學生物工程學院教育部工業微生物技術重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.懷化學院生物與食品工程學院，湖南 懷化 418000)

隨著世界范圍內能源和資源的日益緊張，可再生能源與資源的研究與開發已成為關注熱點。近幾年，各國紛紛開始在微藻生物燃料和營養化學品領域謀求突破與發展：美國能源部宣布將投資1 800萬美元用于藻類生物燃料與生物基產品研究；歐盟也積極投資藻類研究，旨在示范從藻種選育、培養條件優化、油脂提取、生物燃料生產等過程[1]。微藻在食品資源方面的利用涉及到裂殖壺菌，又稱裂壺藻，是屬于破囊壺菌科的單細胞海洋微藻，在一定的培養條件下，裂殖壺菌胞內油脂中二十二碳六烯酸(DHA，C22:6)含量較高，是值得研究和深度開發的生物合成DHA的優質種源[2]。

DHA為ω-3多不飽和脂肪酸，是一種重要的食品添加劑。它是大腦和視網膜的重要組成成分，還具有抗癌、消炎、預防心血管疾病等諸多功能[3-4]，其保健和醫療功效越來越受到重視。與傳統的深海魚油生產DHA的方式相比，裂殖壺菌發酵生產DHA具有培養簡單、無季節波動、目的產物含量比高、無污染、無魚腥味、成本低、不影響海洋生態等優點[5]，裂殖壺菌發酵生產DHA開始進入了工業化階段[6]。

近些年，不斷見到優化裂殖壺菌發酵，提高DHA產量的研究報道，如發酵培養基優化[7-9]、pH調控[10-11]、溶氧調控[12-14]、補料策略優化[15]等，靠傳統發酵策略提高DHA的發酵生產強度的余地越來越小。而借助遺傳育種手段，培育高產DHA的裂殖壺菌變異株仍有一定的發展空間，這也是發酵法提高DHA生產強度的上游基礎。

裂殖壺菌基因組約39 Mb[16]，且裂殖壺菌代謝體系中脂肪酸合成途徑復雜，既存在短鏈飽和脂肪酸的脂肪酸合酶(fatty acid synthase, FAS)合成途徑，又存在長鏈不飽和脂肪酸的聚酮合酶(polyketide synthase, PKS)的合成通路[17]。盡管基因工程已普遍應用于微生物育種，并且在裂殖壺菌上也有所研究[18-19]，但考慮到裂殖壺菌復雜的遺傳背景和尚不十分明晰的DHA合成途徑，物理和化學誘變仍舊是可以考慮的選擇。

甲基磺酸乙酯(EMS)誘變為化學誘變，其作用機制是對DNA上高密度的堿基進行烷化作用，形成轉換型或置換型突變[20]。目前EMS誘變在微生物育種以及農作物的優良品種選育上廣泛應用，并獲得了不錯的效果[21-22]。常壓室溫等離子體(ARTP)是一種新型的誘變技術，它利用大氣壓輝光放電，產生多種活性粒子，作用于DNA上，引發基因突變[23]，它具有操作簡單、可控性強、誘變效果好的特點，已逐步開始在科研與工業領域發揮重要作用[24]。由于單種誘變方法往往會使菌種產生抗性，或得到的誘變菌株性能不夠穩定，在實際應用中往往采用2種或多種誘變方式相結合的方法進行誘變，即復合誘變[25]。

裂殖壺菌具有多層的細胞壁結構保護著胞內物質[26]，DHA的合成途徑與代謝機制又十分復雜。以往針對裂殖壺菌的育種手段往往采用單一的誘變方法，這會產生誘變效果差、誘變效率低或誘變株性能不穩定、易退化等問題，如呂曉義等[27]僅僅利用60Co-γ射線輻照誘變裂殖壺菌，獲得的誘變菌產量只有5.65 g/L；梁園梅等[28]采用單一UV誘變育種，獲得的誘變株性能也沒有突出的提升。欲獲得性狀良好、遺傳穩定的裂殖壺菌高產DHA變異株，本研究將EMS-ARTP復合誘變方法應用于裂殖壺菌誘變育種，以期獲得裂殖壺菌高產DHA誘變菌。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

菌株：裂殖壺菌(Schizochytriumsp.S31，ATCC 20888)，美國菌種保藏中心；

脂肪酸：標準品，美國Sigma公司；

正己烷：HPLC級，美國Fisher公司；

其他試劑：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

離心機：3K15型，德國Sigma公司；

分光光度計：T6新世紀型，北京普禧通用儀器有限公司；

ARTP誘變儀：ARTP-III型，北京思清源生物科技有限公司；

氣相色譜儀：GC-2010型，日本島津公司。

1.1.3 培養基

790 By+固體培養基：葡萄糖5 g/L、胰蛋白胨1 g/L、酵母粉1 g/L、瓊脂20 g/L、海水晶17.5 g/L，121 ℃ 滅菌20 min；

種子培養基：葡萄糖30 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、海水晶15 g/L、VB10.05 g/L、VB60.05 g/L、VB120.000 5 g/L，115 ℃滅菌20 min；

發酵培養基：葡萄糖100 g/L、胰蛋白胨5.6 g/L、谷氨酸鈉20 g/L、磷酸二氫鉀2.5 g/L、硫酸鎂7.2 g/L、硫酸鈉 12.8g/L、氯化鈣 0.4 g/L、海水晶17.5 g/L、VB10.1 g/L、VB60.1 g/L、VB120.001 g/L，115 ℃滅菌20 min；

0.2 mol/L PBS緩沖液(pH 7.2)：用雙蒸水分別溶解24.00 g 磷酸二氫鈉和28.39 g磷酸氫二鈉至1 000 mL，然后混合280 mL磷酸二氫鈉溶液和720 mL磷酸氫二鈉溶液，121 ℃滅菌20 min，備用；

EMS溶液：取5 mL EMS原液，加入到15 mL預冷的乙醇溶液中，加蓋并輕輕轉動試管混合均勻。

1.2 方法

1.2.1 裂殖壺菌誘變菌株制備

(1) 菌懸液制備：將裂殖壺菌接種于裝有50 mL種子培養基的250 mL搖瓶中，28 ℃、200 r/min培養2 d。取1 mL培養液3 000 r/min離心5 min收集菌體，用PBS緩沖液洗滌2次后稀釋至OD540為0.6～0.7(以PBS緩沖液為參比管)。

(2) EMS誘變株制備：在10 mL菌懸液中加入400 μL EMS溶液，輕輕搖勻后置于搖床，28 ℃、200 r/min條件下分別處理0，10，20，30，40，50，60 min(0 min為對照組)，取出后用5%硫代硫酸鈉溶液洗滌2～3次終止反應，細胞用PBS緩沖液懸浮后吸取100 μL均勻涂布于固體培養基平皿上，置于30 ℃避光培養4 d。

(3) ARTP誘變株制備：吸取20 μL菌懸液，均勻涂抹在滅過菌的載物鐵片上，將鐵片置于ARTP誘變儀載物臺上，用高純氦氣等離子體誘變分別處理0(對照組)，5，10，15，20，25 s，誘變參數為：電源功率100 W，氦氣流量10 L/min，照射距離2 mm。ARTP誘變處理后，將鐵片轉移至裝有1 mL PBS緩沖液的EP管中，震蕩洗脫菌體。吸取100 μL菌體懸浮液均勻涂布于固體培養基平皿上，置于30 ℃避光培養4 d。

(4) EMS-ARTP復合誘變菌制備：將EMS誘變處理40 min 后制備的誘變菌懸液吸取100 μL均勻涂布于固體培養基平皿上，置于30 ℃避光培養4 d。混合平皿上長出的單菌落，并挑取一環，接種于裝有50 mL種子培養基的250 mL搖瓶中，按1.2.1(1)制備菌懸液，然后按1.2.1(3)經ARTP照射誘變15 s，獲得EMS-ARTP復合誘變菌。其中對照組EMS處理時間0 min，ARTP照射時間0 s。

1.2.2 致死率、突變率計算

(1) 致死率計算：各誘變試驗中，對對照組和誘變組固體培養基平皿上長出的菌落進行計數。按式(1)計算致死率。

(1)

式中：

rL——致死率，%；

N0——對照組菌落數；

Nm——誘變組菌落數。

(2) 突變率計算：各誘變試驗中，選取致死率為80%～90%的處理時間作為最終誘變時間。在該誘變時間下對裂殖壺菌進行誘變處理，平板培養4 d后各組隨機挑選50株菌，搖瓶培養120 h后測DHA產量，記產量高于原始菌株10%的誘變株為正突變株，產量低于原始菌株10%的誘變株為負突變株，并按式(2)計算突變率。

(2)

式中：

rm——突變率，%；

rP——正突變率，%；

rN——負突變率，%；

NP——正突變株菌株數；

NN——負突變株菌株數。

1.2.3 分析方法

(1) 生物量測定：各誘變株搖瓶培養120 h后，取5 mL發酵液于離心管中，8 000 r/min離心15 min，用雙蒸水洗滌離心2次，冷凍干燥后稱重計算生物量。

(2) 含油量測定：采用磷酸香草醛法[29]。

(3) 脂肪酸含量測定：采用氣相色譜法[11]。

各誘變組選取5株DHA產量最高的菌株，其發酵平均水平作為該誘變方法下得到的高產菌的發酵水平。

2 結果與分析

2.1 誘變劑量的確定

2種誘變方法對裂殖壺菌的致死效應見圖1。裂殖壺菌菌體的致死率與EMS處理時間存在明顯的正相關效應，當EMS處理時間為40 min時，致死率達到87%。因此，選取40 min作為EMS處理的誘變劑量。

裂殖壺菌菌體的致死率隨著ARTP照射時間的延長而顯著增加。當照射時間在15 s以上時，致死率曲線趨于平緩，可能是細胞SOS修復機制的激活，突變率開始增加[30]。此時，裂殖壺菌的致死率達到80%以上。因此，選取15 s作為ARTP照射的誘變劑量。

從圖1可以看出，對裂殖壺菌誘變的化學處理中，致死率對應于處理時間，形成較為平緩的上升曲線，而物理誘變中，致死率對應于照射時間則顯得陡峭，說明準確掌控照射時間點非常重要。

圖1 2種誘變方法對裂殖壺菌的致死效應Figure 1 Lethal effects of 2 mutagenesis factors to Schizochytrium sp.31 (n=3)

2.2 EMS、ARTP和EMS-ARTP處理突變率的對比

分別使用EMS、ARTP和EMS-ARTP復合誘變3種誘變方法對裂殖壺菌進行誘變處理，并對誘變株進行搖瓶培養后測DHA產量，統計正、負突變率，結果見圖2。3種誘變方法對裂殖壺菌的誘變效果呈現出一定的差異性。比較2種單因子誘變方法，裂殖壺菌突變率相差不大，介于40%與45%之間，但是在ARTP突變株中，正突變株的數量占到約60%，遠高于負突變株；而在EMS突變株中，正、負突變株數量相當。EMS-ARTP復合誘變后，突變率達到55.7%，明顯高于2種單因子誘變。其中正突變率達到32.2%，遠遠高于負突變率。

對裂殖壺菌而言，3種突變方法形成的突變率截然不同。表觀上分析，推測EMS-ARTP復合誘變造成了更豐富的突變位點，因此回復突變的頻率遠遠低于單因子誘變。

圖2 3種誘變方法對裂殖壺菌誘變處理的突變率Figure 2 Mutation rate of 3 mutagenesis factors to Schizochytrium sp.31 (n=3)

2.3 高產誘變株的關鍵發酵指標類比

從3種誘變方法獲得的誘變株當中各挑選5株DHA產量最高的菌株，其發酵平均水平作為該誘變方法下得到的DHA高產菌株的發酵水平，結果見表1、2。從表1可知，與出發菌株相比，3種DHA高產菌株的生物量無明顯的變化，而在含油量上，均有不同程度的提高，其中EMS誘變高產株含油量提升略高于ARTP誘變的，而復合誘變高產株含油量最高，達到51%。如表2所示，EMS誘變高產株的DHA較出發菌株無明顯變化，而ARTP誘變高產株和復合誘變高產株DHA含量均得到了提升，分別約為40%和43%。基于上述變化，最終3種誘變菌的DHA產量均得到了一定程度的提升，其中EMS-ARTP復合誘變高產株的產量達到了7.2 g/L，提升了近36%，效果最明顯。

3種DHA高產菌株的脂肪酸組成與出發菌株具有明顯的差異，見表2。EMS誘變高產株的主要FAS產物，如C14∶0和C16∶0略有增加，主要PKS產物二十二碳五烯酸(DPA)出現下降現象；而ARTP和復合誘變高產株的FAS產物和PKS產物變化與EMS誘變高產株正好相反，如復合誘變高產株的FAS產物由原始菌株的42.3%下降到38.6%，而PKS產物由原始菌株的44.9%上升到55.2%。

表1不同高產DHA裂殖壺菌誘變株發酵性能分析?
Table 1 Analysis of fermentation performances on different high DHA yieldSchizochytriummutants (n=3)

菌株生物量/(g·L-1)含油量/%DHA產量/(g·L-1)w36．41±1．3645．51±2．085．28±0．35mEMS37．01±1．2848．45±2．585．74±0．33mARTP36．82±1．5547．94±2．676．28±0．28mEA36．88±1．2751．15±2．077．16±0．30

? w：原始菌株；mEMS：EMS誘變菌株；mARTP：ARTP誘變菌株；mEA：EMS-ARTP復合誘變菌株。

表2 不同高產DHA裂殖壺菌誘變株脂肪酸組成?Table 2 Fatty acids composition of different high DHA yield Schizochytrium mutants (n=3) %

? w：原始菌株；mEMS：EMS誘變菌株；mARTP：ARTP誘變菌株；mEA：EMS-ARTP復合誘變菌株。

2.4 高產誘變株遺傳穩定性

將3種誘變方法獲得的高產DHA誘變株進行連續傳代培養，考察其遺傳的穩定性，結果見圖3。經過5代的傳代培養，EMS誘變高產株和ARTP誘變高產株的發酵指標都出現了一定程度的退化，而復合誘變高產株的發酵指標保持相對穩定，其DHA含量為42.2%～43.3%，DHA產量為7.0～7.2 g/L，與一代菌無明顯差異，遺傳穩定性良好。

2.5 誘變方法對裂殖壺菌誘變機理

由3種誘變方法對裂殖壺菌的誘變結果分析可知，EMS產生的誘變效果弱于ARTP，而復合誘變的效果最好。EMS具有烷化DNA堿基的機理，可引發嘌呤和嘧啶轉換[22]。在本試驗中，EMS誘變高產株的含油量高于出發菌株，但DHA占總脂肪酸的相對含量與出發菌相比相差不大，說明其脂肪酸合成能力得到了提升，但DHA合成的特定代謝途徑并未增強。

ARTP誘變為新型的誘變育種方法，它集合了質量、能量和電荷等損傷因素，產生不同的DNA損傷機制，遺傳多樣性更豐富[31]。Umu-test顯示ARTP對基因的損傷能力遠高于UV和常規化學誘變方法[32]。ARTP輻射的高活性粒子溫度接近室溫，不會對菌體產生熱致死效應。在本試驗中，將ARTP誘變技術應用于裂殖壺菌選育高產DHA菌株，取得了良好的效果，正突變率遠遠高于負突變率。通過發酵數據和脂肪酸組成的分析可以發現，ARTP高產株的含油量和DHA產量明顯提升，而且脂肪酸組成中PKS產物也有了相應的提升，說明誘變株在合成脂肪酸前體物質的相關合成基因和PKS途徑的特定基因都有可能發生了變異。

考慮到裂殖壺菌復雜的脂肪酸合成途徑，單點或少數幾個點的誘變往往不能對DHA的產量產生顯著、穩定的改變。將化學誘變和物理誘變相結合，對裂殖壺菌進行EMS-ARTP復合誘變，誘變機制更多樣，突變位點更豐富，獲得DHA高產菌的概率也更大。通過EMS-ARTP復合誘變得到的高產菌株，DHA產量達到7.2 g/L。李慧玲等[33]采用DES-UV復合誘變結合丙二酸、碘乙酸聯合篩選，得到誘變菌株XN001，其DHA產量為5.5 g/L；許永等[34]采用紫外誘變和喹禾靈篩選的方法，篩得的菌株OUC007，其DHA產量為1.2 g/L；袁軍等[35]通過ARTP誘變與強氧化劑施壓篩選得到的菌種D32，其DHA產量達到7.3 g/L。通過本試驗的誘變方法篩選得到的高產誘變菌株，在未使用任何篩選試劑的情況下，已獲得較高DHA產量。該產量與近期報道的相同菌種、相同發酵規模的數據相比，已十分具有競爭力(表3)。后期經過合適的篩選方法和發酵培養優化后，有望進一步提高DHA生產能力。

表3 不同破囊壺菌DHA產量和DHA含量比較Table 3 Comparative results of DHA production and percentage among different studies by thraustochytrids

圖3 高產誘變株傳代次數對發酵指標的影響Figure 3 Effects ofculture passages on fermentation performance of high DHA yield Schizochytrium mutants

3 結論

將EMS-ARTP復合誘變的方法應用于裂殖壺菌誘變選育高產DHA菌株，并對復合誘變獲得的DHA高產菌株與單因子誘變高產菌株進行比較分析得出，EMS-ARTP復合誘變高產菌株無論在DHA產量還是在遺傳穩定性上，都優于單因子誘變。再加上后期的理性篩選技術及定向施壓培養的應用，有望進一步提高裂殖壺菌合成DHA的產率，繼而提高工業化生產DHA的效能。

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