馬鈴薯蛋白ACE抑制肽的Plastein反應修飾研究

2018-05-03 01:51:38高丹丹

食品與機械 2018年2期

高丹丹

馬忠仁

熱孜萬古力·賽買提

田曉靜

李明生

陳士恩

(西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州 730124)

Plastein反應又稱類蛋白反應或塑蛋白反應，是指在一定條件下，蛋白酶催化高濃度的蛋白質水解物或低聚肽的混合物，生成沉淀、觸變膠體或具觸變性黏稠的膠狀類蛋白產物的過程[1]。一般認為Plastein反應是蛋白酶存在下蛋白質水解反應的逆反應，分為水解、濃縮和合成三步[2]。該反應的機理較為復雜，可能涉及水解反應、濃縮作用、轉肽作用、物理聚集中的一種或幾種[3]。Plastein反應能夠產生原料蛋白質所沒有的新肽段，其產物具有與原料蛋白質不同的氨基酸序列，可以去除蛋白質水解物的苦味，改善蛋白質的功能性質，提高蛋白質的營養價值，已成為食品工業研究的熱點[4]。

目前采用Plastein反應修飾生物活性肽的研究較多，諸如：吳丹等[5]曾對酪蛋白進行酶水解及Plastein修飾改善其抗氧化性；楊鋒等[6]曾對醋蛋水解物進行類蛋白修飾,并初步研究了產物的抗氧化活性；張強等[7]研究發現雙孢蘑菇源抗氧化肽修飾產物的抗氧化活性大概是修飾前的4倍；王晗欣等[8]研究發現鷹嘴豆蛋白抗氧化肽修飾產物的還原力和羥自由基清除率都有顯著提高；汪敬科等[9]采用Plastein反應在堿性蛋白酶存在條件下對酪蛋白水解物進行修飾，制備多個不同修飾程度的Plastein反應產物，修飾后其ACE抑制活性逐漸增加(增加至49%～62%)。上述研究表明，Plastein反應修飾可以顯著提高某些生物活性肽的功效。但Plastein反應用于改善馬鈴薯蛋白源ACE抑制肽活性的研究還未見報道。因此，本研究擬以馬鈴薯蛋白為原料，在前期研究[10-11]的基礎上，采用胰蛋白酶水解馬鈴薯蛋白制備ACE抑制肽，對馬鈴薯蛋白ACE抑制肽進行Plastein反應修飾，并對修飾的工藝條件進行研究，以期提高馬鈴薯蛋白ACE抑制肽的活性，為天然高效ACE抑制劑的制備提供一種新途徑，為馬鈴薯蛋白資源的綜合開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

馬鈴薯：隴薯10號，購自蘭州市物美大賣場；

馬鈴薯蛋白ACE抑制肽：ACE抑制率為(61.20±0.15)%，實驗室自制。

胰蛋白酶：10 000 U/mg，美國Sigma-Aldrich公司；

ACE：2.0 U/mg，美國Sigma-Aldrich公司；

馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(HHL)：分析純，美國Sigma-Aldrich公司；

十二烷基磺酸鈉：分析純，天津市光復精細化工研究所；

鄰苯二甲醛：分析純，北京索萊寶生物試劑；

甘氨酸、L-纈氨酸、L-組氨酸、L-酪氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-賴氨酸、亮氨酸：分析純，上海中秦化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

紫外分光光度計：UV-2000型，尤尼柯(上海)儀器有限公司；

臺式高速冷凍離心機：TGL-16型，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；

恒溫磁力攪拌器：MYP11-2A型，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；

鼓風干燥箱： DHG-9030型，上海一恒科學儀器有限公司；

電子天平：FA2004B 型，上海精密科學儀器有限公司；

冷凍干燥機：Megafuge 8R型，美國熱電照生有限公司；

數顯酸度計：PHS-3C型，杭州雷磁分析儀器廠；

超低溫冰箱：DW-86L490J型，青島海爾特種電器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 馬鈴薯蛋白質的提取馬鈴薯洗凈削皮切丁，用一定量的0.09% NaCl溶液和0.12%的亞硫酸鈉混合液在室溫下浸提1 h左右，馬鈴薯與提取液的比值為1∶10 (g/mL)，-4 ℃，3 000 r/min離心15 min，取上清液，加入1 mol/L HCl溶液調pH 4.2左右，于磁力攪拌器上攪拌10 min，靜止1 h，再于-4 ℃，3 000 r/min離心15 min，保留沉淀，置于冷凍干燥機中凍干，得到馬鈴薯蛋白粉[10]。

1.2.2 馬鈴薯蛋白ACE抑制肽的制備工藝

馬鈴薯蛋白懸濁液→調pH→加酶→調水浴溫度37 ℃→滅酶(90 ℃水浴15 min)→離心(10 000 r/min，20 min)→取上清液→冷凍干燥[11]

1.2.3 ACE抑制率測定將ACE底物HHL溶解于0.1 mol/L 硼酸鹽緩沖液(pH值8.3，含0.2 mol/L NaCl)中配制成6 mmol/L的濃度。取100 μL的HHL與100 μL的ACE抑制劑混合，然后加入150 μL 5 U/mL的ACE溶液，37 ℃ 反應60 min。加入250 μL的HCl(1 mol/L)終止反應，再加入1.5 mL乙酸乙酯進行萃取，強烈震蕩1 min，3 000 r/min 離心5 min。取酯層部分0.5 mL，在110 ℃下蒸干。繼續加入3 mL氯化鈉溶液(1 mol/L)溶解殘渣，以1 mol/L 氯化鈉溶液作參比，在228 nm下測定其吸光值記做S，用蒸餾水代替酶解肽，步驟同上，測定其吸光值記做A，用蒸餾水代替粗酶液和酶解肽液，測定其吸光值記做C[12]。按式(1)計算ACE抑制率：

(1)

式中：

N——ACE抑制率，%；

A——在反應中不加抑制劑的吸光值；

S——在反應中同時加入ACE和ACE抑制劑的吸光值；

C——ACE與HHL空白反應的吸光值。

1.2.4 單因素試驗以Plastein反應產物ACE抑制率為指標，分別研究外源氨基酸的種類、酶與底物濃度比([E]/[S])、反應溫度、反應pH、反應時間對ACE抑制率的影響。

(1) 外源氨基酸的種類：稱取15 g的馬鈴薯蛋白ACE抑制肽于試劑瓶中，加50 mL蒸餾水配制成底物濃度為30%的懸浮液，按0.5 mmol/g·多肽的比例分別加入甘氨酸、亮氨酸、酪氨酸、賴氨酸、組氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸，調節pH值為8.0，反應溫度37 ℃，反應時間2 h，[E]/[S] 3 000 U/g，95 ℃滅酶10 min，10 000 r/min 離心5 min，取上清液，測定Plastein反應產物ACE抑制率。

(2) [E]/[S]：稱取15 g的馬鈴薯蛋白ACE抑制肽于試劑瓶中，加50 mL蒸餾水配制成底物濃度為30%的懸浮液，按0.5 mmol/g·多肽的比例加入甘氨酸，調節pH值為8.0，反應溫度37 ℃，反應時間2 h，分別控制[E]/[S]為 2 500，3 000，3 500，4 000，4 500 U/g，95 ℃滅酶10 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液，測定Plastein反應產物ACE抑制率。

(3) 反應溫度：稱取15 g的馬鈴薯蛋白ACE抑制肽于試劑瓶中，加50 mL蒸餾水配制成底物濃度為30%的懸浮液，按0.5 mmol/g·多肽的比例加入甘氨酸，調節pH值為8.0，分別控制反應溫度為32，37，42，47，52 ℃，反應時間2 h，[E]/[S] 3 500 U/g，95 ℃滅酶10 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液，測定Plastein反應產物ACE抑制率。

(4) 反應pH：稱取15 g的馬鈴薯蛋白ACE抑制肽于試劑瓶中，加50 mL蒸餾水配制成底物濃度為30%的懸浮液，按0.5 mmol/g·多肽的比例加入甘氨酸，分別控制pH值為7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，反應溫度42 ℃，反應時間2 h，[E]/[S] 3 500 U/g，95 ℃滅酶10 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液，測定Plastein反應產物ACE抑制率。

(5) 反應時間：稱取15 g的馬鈴薯蛋白ACE抑制肽于試劑瓶中，加50 mL蒸餾水配制成底物濃度為30%的懸浮液，按0.5 mmol/g·多肽的比例加入甘氨酸，調節pH值為8.0，反應溫度42 ℃，分別控制反應時間為2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 h，[E]/[S] 3 500 U/g，95 ℃滅酶10 min，10 000 r/min 離心5 min，取上清液，測定Plastein反應產物ACE抑制率。

1.2.5 響應面分析在單因素的基礎上，根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，以馬鈴薯蛋白ACE抑制肽的抑制率為響應值，選擇反應溫度、反應pH、[E]/[S]進行三因素三水平的響應面試驗。通過響應面分析法優化Plastein反應修飾的工藝條件。

1.2.6 數據分析采用F檢驗對試驗數據進行方差分析來評價響應面回歸模型的統計意義，采用Design-Expert V 8.0.6 軟件對數據進行分析。

2 結果分析

2.1 單因素分析

2.1.1 外源氨基酸種類對馬鈴薯蛋白ACE抑制肽Plastein反應的影響由圖1可知，加入8種外源氨基酸之后，馬鈴薯蛋白ACE抑制肽修飾產物對血管緊張素轉化酶均表現出一定的抑制活性。加入甘氨酸后，修飾產物的ACE抑制率最高達到了(75.1±2.12)%，L-苯丙氨酸加入后ACE抑制率最低，為(49.1±0.82)%。添加亮氨酸、L-酪氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-纈氨酸和L-甲硫氨酸后的ACE抑制率依次為(73.70±1.24)%，(71.10±1.43)%，(67.90±0.11)%，(62.20±1.05)%，(59.30±1.04)%，(53.20±0.98)%。表明甘氨酸對馬鈴薯蛋白ACE抑制肽的Plastein反應修飾效果最好，故選用甘氨酸為最佳外源氨基酸。

圖1 外源氨基酸種類對馬鈴薯蛋白ACE抑制肽的Plastein反應的影響Figure 1 The effect of extrinsic amino acid on ACE inhibitory activity

2.1.2 [E]/[S]對馬鈴薯蛋白ACE抑制肽Plastein反應的影響由圖2可知，隨著[E]/[S]的增加，抑制率隨之增大，但增加到3 500 U/g時，ACE抑制率達到最大值[(79.30±0.95)%]，繼續增加加酶量，抑制率減小。隨著[E]/[S]的增大，Plastein反應修飾程度達到最大，但此時修飾產物的ACE抑制率降低，可能是[E]/[S]過大，過多的蛋白酶容易催化修飾產物重新發生水解反應，促使體系中活性物質減少，進而導致其ACE抑制率降低[13]。故選擇3 500 U/g 作為響應面試驗的中心點。

圖2 酶與底物濃度比對ACE抑制率的影響Figure 2 The effect of Enzyme/Substrate ratio on ACE inhibitory activity

2.1.3 反應溫度對馬鈴薯蛋白ACE抑制肽Plastein反應的影響由圖3可知，ACE的抑制率會隨著溫度的增加呈先上升后下降的趨勢。當溫度為42 ℃時，ACE抑制率達到最大值[(78.95±0.42)%]。溫度對ACE抑制肽抑制率的影響主要是通過影響酶的活性實現的。當溫度低于42 ℃時，隨著酶解溫度的增大，酶促反應速度加快，ACE抑制率也逐步增大，而當溫度超過42 ℃時，隨著溫度的升高，酶可能失活而導致抑制率下降[14]。故選擇42 ℃作為響應面試驗的中心點。

圖3 反應溫度對ACE抑制率的影響Figure 3 The effect of reaction temperature on ACE inhibitory activity

2.1.4 反應pH值對馬鈴薯蛋白ACE抑制肽Plastein反應的影響由圖4可知，隨著pH值的增大，馬鈴薯蛋白ACE抑制肽修飾產物的ACE抑制率先增大后減小，pH 8.0時，修飾產物的ACE抑制率最高，達到(79.20±0.65)%。低于或高于此pH值，修飾產物的ACE抑制能力均有不同程度的減弱，可能是偏酸性或偏堿性環境會引起蛋白酶和底物蛋白發生一定程度的變性，從而使蛋白酶失去部分催化功能，底物蛋白喪失部分生物活性，進而減弱修飾產物的ACE抑制能力[15]。故選擇8.0作為最佳反應pH值。

圖4 反應pH值對ACE抑制率的影響Figure 4 The effect of reaction pH on ACE inhibitory activity

2.1.5 反應時間對馬鈴薯蛋白ACE抑制肽Plastein反應的影響由圖5可知，隨著反應時間的延長，馬鈴薯蛋白ACE抑制肽修飾產物的ACE抑制率隨之上升，但是當時間達到3.0 h時ACE抑制率達到最大值[(79.7±1.22)%]，反應時間繼續延長，ACE抑制率下降。這可能是反應時間過長，修飾產物在蛋白酶的作用下又發生了水解反應，重新生成了分子質量相對較小的肽類物質，修飾程度降低[16]。故選擇3.0 h 作為響應面試驗的中心點。

圖5 反應時間對ACE抑制率的影響Figure 5 The effect of reaction time on ACE inhibitory activity

2.2 馬鈴薯蛋白ACE抑制肽Plastein反應修飾響應面試驗分析

2.2.1 響應面試驗設計見表1。

2.2.2 多元二次模型方程的建立與檢驗通過Design-Expert V8.0.6軟件對表2數據進行回歸分析得到多元二次關系式：

Y=82.84+0.28A+0.27B+0.21C+0.14AB-0.14AC-0.15BC-0.43A2-1.40B2-0.98C2。

(2)

表1 響應面試驗設計Table 1 Designs of Response surface experiment

表2 Box-Behnken試驗設計及結果
Table 2 The design and experiment results of Box-Behnken Response surface test

序號ABCACE抑制率/%試驗值預測值10．00-1．001．0080．89±0．1580．5620．000．000．0083．05±0．0582．843-1．001．000．0081．12±0．0280．8641．00-1．000．0080．63±0．0580．8950．001．001．0080．79±0．2180．7861．001．000．0081．76±0．1681．707-1．00-1．000．0080．55±0．1380．618-1．000．00-1．0080．87±0．0980．8191．000．00-1．0081．93±0．1481．66100．000．000．0082．54±0．0582．8411-1．000．001．0081．24±0．0881．51120．00-1．00-1．0079．83±0．0479．84130．000．000．0082．94±0．0982．84141．000．001．0081．72±0．2381．79150．001．00-1．0080．35±0．3480．68160．000．000．0082．86±0．1582．84170．000．000．0082．83±0．1382．84

表3 二次多項模型方差分析結果?Table 3 The variance analysis results of two multinomial models

2.2.3 響應面分析和優化由圖6可知，反應溫度與反應pH值、反應溫度與[E]/[S]以及pH值和[E]/[S]的交互作用對修飾產物的ACE抑制率無顯著影響。當[E]/[S]固定在0水平時，隨著反應pH值的升高，修飾產物的ACE抑制能力呈現出先增大后減小的趨勢；隨著反應溫度的升高，修飾產物的ACE抑制能力逐漸增大。當pH值固定在0水平時，隨著[E]/[S]的升高，修飾產物的ACE抑制能力呈現出先增大后減小的趨勢；隨著反應溫度的升高，修飾產物的ACE抑制能力逐漸增大。當溫度固定在0水平時，隨著[E]/[S]的升高，修飾產物的ACE抑制能力呈現出先增大后減小的趨勢，可能是由于過量的蛋白酶會引發修飾產物發生二次水解，使體系中抗氧化活性物質的數量有所減少，從而影響修飾產物的ACE抑制能力；隨著反應pH值的升高，修飾產物的ACE抑制能力也呈現出先增大后減小的趨勢。

圖6 交互作用影響抑制率的曲面圖及等高線圖Figure 6 Surface chart and contour map of the interaction affect the ACE inhibitory activity

2.2.4 模型驗證實驗根據Box-Behnken設計的17組試驗所得的結果和二次多項回歸方程，利用Design Expert V 8.0.6 軟件獲得了ACE抑制率最高時各個因素的最佳反應條件為：溫度43.68 ℃、反應pH 8.05、反應時間3.0 h，[E]/[S] 3 565.05 U/g，在此反應條件下，經由Plastein反應修飾的馬鈴薯蛋白ACE抑制肽對ACF的理論抑制率為(82.913±0.958)%。

為了檢驗模型預測的準確性和精確性，在最適反應條件下進行修飾反應并測定產物的ACE抑制率，3組平行實驗所得到的實驗結果分別為82.86%，82.95%，82.85%，平均值為(82.89±0.05)%，由此可見該模型能較好地預測實際反應情況。

3 結論

采用胰蛋白酶水解馬鈴薯蛋白制備ACE抑制肽(ACE抑制率為61.20%±0.15%)，以ACE抑制能力為評價指標，在單因素試驗的基礎上采用響應面法優化了馬鈴薯蛋白ACE抑制肽Plastein反應修飾工藝，得最佳工藝為：以甘氨酸為處源氨基酸，溫度43.68 ℃、反應體系pH 8.05、反應時間3.0 h、[E]/[S] 3 565.05 U/g，底物濃度30%、外源氨基酸比例0.5 mmol/g·多肽，在最優反應條件下，抑制率可以達到(82.89±0.05)%。本研究通過Plastein反應修飾的方法有效提高了馬鈴薯蛋白ACE抑制肽的降血壓活性，為其作為天然高效降血壓劑方面的開發提供依據，并為馬鈴薯資源的綜合利用提供新途徑。

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