外源轉基因片段從轉基因棉籽殼到食用菌水平轉移研究

白亞龍

索玉娟

林 婷

沈源源

趙曉燕

劉海燕

周昌艷

(上海市農業科學院農產品質量標準與檢測技術研究所，上海 201403)

食用菌蛋白質含量高，營養豐富，具有增強免疫力、降血糖等保健作用[1]。棉籽殼營養豐富是理想的食用菌栽培原料[2]。中國也是轉基因棉花種植大國，根據國際農業生物技術應用服務組織的報道，在2014年中國轉基因棉花種植面積就已達棉花總種植面積的93%，而且呈不斷增長的趨勢[3]。大量的轉基因棉籽殼會作為培養料用于食用菌栽培，因此，有必要考察外源轉基因片段是否會通過栽培從轉基因棉籽殼水平轉移到所栽培的食用菌中。

在之前的研究中，并沒有達到統一的共識。徐寶梁[4]與于莉[5]分別用轉基因棉籽殼和轉基因油菜籽為主要原料種植平菇，均沒有發現轉基因片段從棉籽殼向平菇水平轉移的現象，用添加有轉基因片段的液體培養基培養平菇菌絲體，也未發現水平轉移現象。然而，馬務超等[6]用轉基因棉籽種植銀耳，在所栽培的銀耳中檢出轉基因啟動子CaMV35S與終止子NOS，但是沒有發現Cry1A片段。閆燕[7]與Ying Shang等[8]用轉基因棉籽種植平菇，采摘不同時期的平菇樣品，經過PCR檢測發現均存在外源轉基因片段CaMV35、NOS、CrylA(b)-CrylA(c)。總之，從目前的研究來看，對于轉基因棉籽殼栽培食用菌是否會發生外源轉基因片段水平轉移現象仍然需要更多的試驗確認與驗證。本研究從銀耳生產基地與菇廠采集以棉籽殼為主要培養物栽培的15份銀耳樣品和10份平菇樣品，此外，還從大中型超市和農貿市場采集47份食用菌樣品，用PCR擴增檢測是否存在轉基因棉籽殼中的外源片段CaMV35S、NOS、CpTⅠ、CryIA(c)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑

溶壁酶：10 U/μL，上海天根生化科技有限公司；

蛋白酶K：40 mAnsom u/mg，美國Merck公司；

基因組DNA提取試劑盒：上海索來寶生物科技有限公司；

2×EasyTaq PCR SuperMix (-dye)-PCR SuperMix：北京全式金生物技術有限公司；

所用水均為滅菌的Milli-Q水。

1.1.2 食用菌樣品

15份轉基因棉籽殼為主原料栽培的銀耳樣品：培養基質中棉籽殼含量>75%，采集自福建福州某銀耳種植基地；

10份以轉基因棉籽殼為主培養物栽培的平菇樣品：棉籽含量約為92%，采摘自上海奉賢莊行某菇廠；

47份市售食用菌樣品(其中平菇10份、杏鮑菇8份、香菇8份、金針菇6份、銀耳6份、海鮮菇4份、白玉菇3份、秀珍菇2份)：上海市閔行區各大中型超市與農貿市場。

1.1.3 引物

PCR擴增所需引物見表1，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.4 儀器

微量臺式離心機：Eppendorf 5415D型，德國Eppendorf公司；

恒溫混勻振蕩器：Thermo Mixer型，德國Eppendorf 公司；

PCR儀：Eppendorf AG型，德國Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

(1) 平菇樣品等(除銀耳外的其他食用菌)基因組DNA提取：稱取少量(約1 g)樣品，倒入適量液氮，立即研磨，重復3次。取研成粉末的樣品100 mg，加200 μL試劑盒所配溶液A，加入10 μL溶壁酶與20 μL RNase A，再加入100 mg玻璃珠，在振蕩器上振蕩約5 min。加入40 μL 50 mg/mL的蛋白酶K，充分混勻，55 ℃孵育30 min。12 000 r/min 離心2 min。將上清轉移到一個新的離心管中，加入200 μL試劑盒所配溶液B。接下來步驟完全參照試劑盒說明書，最終基因組DNA溶解于100 μL緩沖液當中。

(2) 銀耳樣品基因組DNA提取：稱取少量(約1 g)樣品，倒入適量的液氮，立即研磨，重復3次。取研成粉末的樣品50 mg，加400 μL試劑盒所配溶液A，加入10 μL溶壁酶與20 μL RNase A，再加入100 mg玻璃珠，在振蕩器上振蕩約5 min。加入40 μL 50 mg/mL的蛋白酶K，充分混勻，55 ℃ 孵育30 min。加入與溶液等量的10% CTAB溶液，65 ℃ 繼續處理30 min，12 000 r/min離心5 min。取200 μL上清轉移到一個新的離心管中，然后加入200 μL試劑盒所配溶液B。后續步驟同1.2.1(1)。

表1 引物序列匯總Table 1 The sequences of primers for PCR

1.2.2 PCR檢測

(1) PCR擴增體系(25 μL)：12.5 μL 2×EasyTaq PCR SuperMix (-dye)-PCR SuperMix，10 μmmol/L的上下游引物各0.5 μL，加無菌水至25 μL。

(2) PCR熱循環步驟：94 ℃保持5 min，每個循環溫度為94，58，72 ℃下分別保持30 s，共35個循環，最后72 ℃再延伸10 min。擴增產物用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，4S Red Plus核酸染色劑(上海生工)染色觀察結果。

2 結果與分析

2.1 以保守基因擴增結果評價銀耳與平菇所提取基因組DNA

在食用菌樣品的基因組DNA提取中，為了增加DNA提取的效率，參照說明書之外，對有些步驟進行了適當的調整。在提取中，因為銀耳含有大量的膠質，在液氮研磨之后用溶液溶解，即使離心也是呈現黏稠的流體狀，無法用試劑盒所配的層析柱進行操作。參考文獻[9]在處理液中添加10%的CTAB溶液(使終濃度為5%)處理，離心后得到澄清的上層清液。以來自于銀耳種植基地和菇廠的15份銀耳和10份平菇樣品為例，提取的基因組DNA母液在稀釋10倍后，進行內源基因的擴增。平菇樣品擴增平菇β-action基因(引物為AC-r/f)[10-11]，銀耳樣品用真菌通用引物ITS4/5進行擴增。電泳結果均呈現明亮的條帶(圖1)，說明提取的DNA無抑制物，可以進行PCR擴增檢測。

M.DNA Marker NC.陰性對照圖1 15份銀耳樣品與10份平菇樣品的內源基因擴增Figure 1 Amplification of endogenous genes of 15 Tremella fuciformis samples and 10 Pleurotus ostreatus samples

2.2 確定栽培銀耳與平菇所用轉基因棉籽殼中轉基因片段

轉基因序列擴增所需引物參照SN/T 1199—2010，選取CaMV35S啟動子、NOS終止子、結構基因CpTⅠ、CryIA(b)+CryIA(c)、CryIA(c)進行檢測，以上海市某菇廠的棉籽殼為例(圖2)，檢出CaMV35S啟動子、NOS終止子、結構基因CpTⅠ、CryIA(c)，同樣地，在來自于福建銀耳種植基地的棉籽殼中同樣也擴增出了這些基因(對培養料進行檢測，也檢測到這4個基因)。說明這2種棉籽殼來源于品種相同的棉花。不同品種的轉基因棉花所檢測到的序列并不相同，在另一家上海菇廠提供的棉籽殼中，檢測到CaMV35S啟動子、NOS終止子、結構基因CryIA(b)+CryIA(c)、CryIA(c)，而未擴增出CpTⅠ序列。在銀耳養殖基地的15份銀耳樣品與菇廠的10份平菇樣品中只篩查檢出CaMV35S、NOS、CpTⅠ、CryIA(c) 4種轉基因片段。

M.DNA Marker 1.CaMV35S-r/f 2.CpTⅠ-r/f 3.CryIA(b)+CryIA(c)-r/f 4.CryIA(c)-r/f 5.NOS-r/f 6.C18srDNA-r/f NC.陰性對照

圖2 棉籽殼中轉基因序列PCR擴增后電泳圖
Figure 2 Amplification of foreign sequences from genetically modified cottonseed hulls

2.3 轉基因棉籽殼栽培的銀耳與平菇樣品中轉基因片段的檢測

15份新鮮銀耳樣品連同棉籽棒一同收集，提取DNA前銀耳均生長于棉籽棒上，狀態良好。最終PCR結果見圖3，CaMV35S啟動子、NOS終止子、結構基因CpTⅠ、CryIA(c)均沒有檢測到，說明無論啟動子與終止子還是結構基因均沒有發現從轉基因棉籽殼向銀耳發生水平轉移的現象。

M.DNA Marker NC.陰性對照 PC.陽性對照圖3 15份銀耳樣品外源性轉基因片段擴增Figure 3 The amplification of foreign genes in 15 Tremella fuciformis samples

對10份采自菇廠的帶有菌菇棒的平菇樣品做了相同的PCR擴增檢測(提取DNA之前平菇均生長于含有轉基因棉籽殼培養基質上，生長狀態良好)，PCR結果顯示并無目標轉基因片段被擴增(圖4)，說明在平菇樣品內并不存在轉基因片段。雖然有些引物擴增會出現一些非特異性產物，但是在目標條帶大小處并沒有出現相應擴增條帶。

2.4 市售食用菌樣品中外源轉基因片段檢測

在銀耳種植基地和菇廠采集的以轉基因棉籽殼為主要培養料的銀耳和平菇樣品中，沒有檢測到外源轉基因片段。除此之外，還從當地的農貿市場與超市采集食用菌樣品47份，其中，平菇樣品10份、香菇樣品8份、杏鮑菇8份、銀耳樣品6份、蟹味菇樣品4份、秀珍菇樣品2份。這些樣品是市面上常見的食用菌，而且可能會被含有棉籽殼的培養基質栽培。有些食用菌雖然市場常見，但不會用棉籽殼培養，所以未被采集，如屬于草腐菌的雙孢蘑菇。最終的PCR檢測結果(見表2)顯示，47份購買自大中型超市與農貿市場的樣品均沒有檢測到外源轉基因片段。

表2 市售食用菌樣品外源轉基因片段PCR檢測結果?Table 2 The amplification of foreign genes in edible fungi purchased from markets

? +表示陽性；-表示陰性；表示未檢測。

M.DNA maker NC.陰性對照 PC.陽性對照圖4 10份平菇樣品外源性轉基因片段篩查Figure 4 The amplification of foreign genes in 10 Pleurotus ostreatus samples

與之前的一些研究不同，不論是種植基地用轉基因棉籽殼為主要原料栽培的銀耳和平菇，還是采集市售的樣品，均沒有檢測到轉基因棉籽殼中的外源片段。閆燕等[7]與Ying Shang等[8]用轉基因棉籽種植平菇，在栽培的不同時期采樣檢測，均檢測到外源轉基因片段。然而，同時也在平菇中檢測到棉籽的內源基因Sad。出現這種情況，可能性有二：① 基因片段可以通過水分進入平菇菌體內，也就是說不論是轉基因還是非轉基因片段，只要是培養基質中含有的基因片段均可能出現在平菇菌體內，從而被檢測到。如果這樣，與轉基因與否并不相關;② 可能是提取的平菇基因組DNA遭到棉籽殼基因組DNA的污染，所以，不論是棉籽殼中含有的轉基因片段還是內源基因均被檢測到。PCR易于污染，尤其是檢測樣品與陽性樣品在液氮研磨、提取DNA、PCR等操作步驟一同進行的情況下。針對前一種可能，徐寶梁[4]與于莉[5]用額外添加轉基因序列的液體培養液培養平菇菌絲體進行檢測，未在菌絲體中發現外源轉基因片段，也就是說基因片段并不能通過水分進入菌體。當然，即使這種情況存在，也僅僅是外源轉基因片段通過水分進入食用菌菌體，其實質類似于食用菌菌體沾染了微量的棉籽殼核酸物質，并不會引起食品安全方面的憂慮。

3 結論

本研究考察了轉基因棉籽殼的外源轉基因片段是否會通過栽培水平轉移到食用菌中。從銀耳生產基地和菇廠采集用轉基因棉籽殼栽培的15份銀耳樣品與10份平菇樣品，PCR擴增檢測是否存在轉基因棉籽殼中的外源片段CaMV35S、NOS、CpTⅠ、CryIA(c)，結果均沒有發現目標序列被擴增。針對可能會用含有棉籽殼基質培養的市售食用菌，從大中型超市與農貿市場采集47份樣品，通過PCR擴增檢測轉基因棉籽殼中的外源片段CaMV35S、NOS、CpTⅠ、CryIA(b)+CryIA(c)、CryIA(c)，結果也沒有發現目標序列被擴增。總之，通過PCR篩查，未發現轉基因棉籽殼中外源轉基因片段有向所栽培食用菌水平轉移的現象。

本研究未發現外源轉基因片段會從轉基因培養料進入食用菌內，為轉基因培養物栽培食用菌的安全性進行了澄清。當然，這僅僅是定點考察與市場初步篩查的結果，想要得到更多確切的結果，可以考慮在食用菌生長周期澆灌含有人為添加特定外源序列的水，確定外源片段是否會隨水分進入食用菌菌體內，還可以考察培養基物質所含DNA片段是否有可能通過水分進入食用菌菌體內。此外，還可以考慮進一步加大市售食用菌樣品篩查樣本量，用更大量的數據徹底消除生產者與消費者的顧慮。

[1] 肖星凝, 袁婭, 廖霞, 等.食用菌抗氧化活性成分及其抗氧化作用機制研究進展[J].食品與機械, 2016, 32(11): 207-211.

[2] 申進文, 劉超, 張倩, 等.5種培養料對平菇營養成分的影響[J].河南農業科學, 2016, 45(10): 103-106.

[3] 楊陽, 王葉, 范金杰, 等.轉基因棉花 MON757 轉化體特異性PCR檢測方法及應用[J].農業生物技術學報, 2016, 24(6): 908-918.

[4] 徐寶梁.轉基因棉籽培養料栽培平菇過程中Bt蛋白、轉入DNA降解及對平菇、平菇害蟲的影響[D].北京: 中國農業大學, 2005: 65-72.

[5] 于莉.利用轉基因油菜籽栽培平菇安全性分析[D].沈陽: 沈陽農業大學, 2007: 39-52.

[6] 馬務迢, 王凡華, 譚慶云, 等.棉籽殼培養基及栽培銀耳中轉基因成分的PCR分析[J].中國食品學報, 2016, 16(3): 168-175.

[7] 閆燕.轉基因培養料與平菇間基因水平轉移現象的研究[D].保定: 河北農業大學, 2011.

[8] SHANG Ying, YAN Yan, XU Wen-tao, et al.Research on gene mobility and gene flow between genetically modified mon 15985 cotton and pleurotus ostreatus[J].Journal of Food Safety, 2016, 36(3): 423-432.

[9] 王凡華, 馬務迢, 譚慶云, 等.銀耳干品的 DNA 提取及隨機擴增多態性分析[J].食品科學, 2015, 36(4): 172-175.

[10] 史紅鴿, 戚元成, 申進文.一種從平菇菌絲中提取總RNA的方法[J].江西農業學報, 2014, 26(8): 68-70.

[11] CHAI Ran, ZHANG Guang, SUN Qiang, et al.Liposome-mediated mycelial transformation of filamentous fungi[J].Fungal biology, 2013, 117(9): 577-583.