miR-214對PTEN蛋白的影響及其在胃癌細胞中的生物學行為

周曉剛,王 凱,沈小剛,王 林,覃先鵬

胃癌是全球惡性腫瘤中第二大常見的死亡病因，每年估計有100萬新診斷的胃癌患者，病死率約為10%[1-4]。胃癌是一種復雜的遺傳性疾病，有研究表明，幾種致癌基因和腫瘤基因抑制因子與胃癌發生、進展有密切關系[5-8]，但目前最常見胃癌遺傳性分子機制尚未被闡明，所以探討胃癌細胞中的新的分子生物學的作用方式及機制是目前的研究熱點。微小RNA(miRNAs)是一類小型的非編碼核苷酸，長度為18～25 nt[9-10]。目前多種miRNA已被發現在不同的人類惡性腫瘤組織中存在異常表達，可以通過結合負向調節的靶基因因子，對其3'非翻譯區(3'-UTR)進行上調或下調，進而影響相關信號通路的激活起到促癌或抑癌的作用[11]。近年來，越來越多的實驗證據表明miRNAs在腫瘤細胞的生物學行為過程中起重要的調控作用，如細胞增殖、分化、遷移和侵襲等[12-13]。最近一項研究確定了不同的miRNA在胃癌組織中的表達差異情況，22種miRNA在胃癌組織中表達上調，其中包括miR-214[14]。但是，關于miR-214在胃癌具體作用機制及相關作用靶標尚不清楚。本研究調查了miR-214在胃癌組織和細胞株中的表達水平，并通過生物信息學預測PTEN蛋白和miR-214結合序列的相似關系，進一步研究miR-214和PTEN在胃癌細胞株中的調控關系和對生物學行為的影響，為胃癌的發生、發展過程提供一定分子生物學基礎?，F報告如下。

1 資料與方法

1.1臨床標本采集與處理 收集2016年6—12月在醫院手術切除且經病理檢查確診為胃癌的組織60例，同時取癌旁正常胃組織60例。離體后放入4%多聚甲醛溶液中固定。所有患者術前無化療或放療，胃癌為原發病灶并經病理科證實，簽署知情同意書。

1.2細胞株與主要試劑 人胃癌細胞SCG-7901、MGC-803、MGC-823及293U實驗細胞株購買于上海細胞研究所。細胞培養條件：含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，37℃，5% CO2條件下培養。胎牛血清、RPMI 1640培養基均購自Gibco公司。PTEN蛋白兔單克隆抗體購于Abcam(ab32199)。Transwell小室購自美國Millipore公司，Matrigel購自美國BD公司。miR-214-siRNA、PTEN-mimic及對照慢病毒購自上海吉凱制藥技術有限公司。miR-214 qPCR引物以及RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、PCR試劑盒均購自上海吉瑪基因有限公司。

1.3RNA提取和qPCR過程 EP管中加入500 μl的lysis buffer。細胞直接收集好后加入其中裂解。Trozel裂解液提取組織總RNA，逆轉錄，PCR擴增miR-214，使用U6作為內參。反應條件：以100 ng總RNA為模版，逆轉錄cDNA，反應條件為：37℃ 15 min，95℃ 5 min。后根據Kapa PCR試劑盒說明書進行PCR反應。獲得數據以RQ=2-ΔΔCT計算mRNA表達量。實驗重復3次。miR-214引物，上游引物：5′-CGTGTGTAGTCGTAGTCGTGTGACGAT-3′；下游引物：5′-GGCTGTCGATGTAAATGCGCTGATCGA-3′。

1.4實驗分組及細胞株處理 分為miR-214-siRNA組、PTEN-mimic組、對照組和miR-214-siRNA+PTEN-mimic組。將miR-214-siRNA轉染MGC-803細胞作為miR-214-siRNA組；對照組為陰性對照，將對照組mimic轉染MGC-803細胞；miR-214-siRNA+PTEN-mimic組將PTEN-mimic轉染MGC-803細胞(已轉染miR-214-siRNA mimic)。

1.5雙熒光素酶活性測定 將24孔板中的293U細胞與0.4 mg熒光素酶報告載體和0.1 mg含有海腎螢光素酶的pRL-TK對照載體共轉染，根據siPORTneoFX使用方法操作，在轉染后48 h制備裂解物。使用雙熒光素酶報告基因測定系統，轉染24 h后測定熒光素酶活性。對于每個轉染的螢火蟲螢光素酶活性被歸一化為海腎螢光素酶活性。實驗重復3次。miR-214的引物序列：5'-CATTTATCCCTTCTATTGCTGGGCTTTC-3'(正向)和5'-GAGGGCCATAAAAAGCAGAAAGTAATG-3'(反向)。PTEN的引物序列：5'-TGCTGTAGTCGATGCGCGAGTGGCTAGC-3'(正向)和5'-CGTGTGATGTCGATGTCGACGGGGA-3'(反向)。

1.6MTT增殖實驗 將對數期MGC-803胃癌細胞使用胰蛋白酶消化后，制成單細胞懸浮液并以1×103個/孔的密度接種到96孔板中。在細胞培養7 d后，加入20 μl MTT測定液，每孔充分混合均勻，并在37℃下孵育4～6 h。然后使用無菌吸管吸出上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，在室溫下攪拌10 min保證晶體充分溶解。然后在96 h進行MTT測定波長為490 nm時的吸光度，計算MGC-803細胞的增殖情況。實驗重復3次。

1.7Transwell侵襲實驗流程 在24孔板中接種胃癌MGC-803細胞，同時轉染miR-214-siRNA抑制miR-214的表達，常規條件培養24 h。將處理過的各組細胞用胰酶消化,繼而用無血清培養液重懸成細胞懸液備用。將培養小室放入孔板中，小室下層加有胎牛血清的培養液，小室內則加入2×104個/ml的胃癌細胞懸液常規培養48 h后取出小室，用甲醇固定，結晶紫染色15 min，用棉簽小心擦去微孔膜上層細胞。在熒光顯微鏡下給微孔膜下層細胞拍照,每孔拍4個視野計算細胞數。實驗重復3次。

1.8蛋白免疫印跡法檢測蛋白表達水平 用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細胞總蛋白，并將其轉移到硝酸纖維素膜(Bio-Rad，Hercules，CA)。使用5%脫脂牛奶充分封閉膜，并與一抗(PTEN濃度1∶2000)，內參GAPDH(濃度1∶2000)，4℃，孵育過夜。次日，TBST充分沖洗過后，使用二抗辣根酶標記物(濃度1∶2000)孵育2 h，TBST充分沖洗過后，使用碧云天化學發光試劑ECL顯影液檢測目標蛋白的表達水平。使用GAPDH作為蛋白內參對照。實驗重復3次。

2 結果

2.1miR-214和PTEN在胃癌組織和細胞株中的表達水平 miR-214在胃癌組織和癌旁正常胃組織中的表達水平分別為5.86±0.76和1.84±0.23。miR-214在胃癌組織中的表達水平高于癌旁正常胃組織(P<0.05)。PTEN蛋白在胃癌組織和癌旁組織中的表達水平分別為5.23±0.83和2.79±0.46。PTEN蛋白在胃癌組織中的表達水平高于癌旁正常胃組織(P<0.05)。MGC-803、MGC-823、SGC-7901胃癌細胞株中miR-214的表達水平分別為4.25±0.92、2.34±0.52、2.34±0.52。MGC-803胃癌細胞株中miR-214的表達水平高于MGC-823、SGC-7901(P<0.05)。上述實驗結果表明miR-214和PTEN可能在胃癌中扮演促癌因子的作用，后續實驗選取胃癌MGC-803細胞株作為研究對象。

2.2miR-214和PTEN間的調控關系 我們通過生物信息學網站預測發現miR-214和PTEN有相似的結合位點序列，二者之間可能存在一定的調控關系，推測PTEN的3'-UTR含有miR-214靶向結合序列。見圖1。本研究將miR-214-siRNA與PTEN共轉染到293U細胞中，雙熒光素酶報告基因結果顯示：過表達miR-214 PTEN活性為3.84±0.41，對照組為3.76±0.22，差異無統計學意義(P>0.05)；抑制miR-214表達后，PTEN活性為1.24±0.15，對照組為3.51±0.35，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖1 miR-214與PTEN之間的結合位點序列

2.3miR-214對胃癌細胞株PTEN蛋白表達水平、細胞增殖和侵襲能力的影響 miR-214-siRNA組PTEN的表達水平高于對照組。見圖2。對照組和miR-214-siRNA組MGC-802細胞株的細胞增殖能力分別為0.59±0.12和0.28±0.05，48 h后穿膜細胞數分別為(150.36±11.35)和(52.31±6.32)個。miR-214-siRNA組MGC-802細胞株的細胞增殖能力較對照組弱，穿膜細胞數少于對照組(P<0.05)。見圖3。

圖2miR-214對胃癌細胞株PTEN蛋白表達水平的影響

圖3miR-214對胃癌細胞侵襲能力影響(結晶紫染色×40)

2.4PTEN對胃癌細胞株PTEN蛋白表達水平、細胞增殖和侵襲能力負調控作用 與miR-214-siRNA組相比，miR-214-siRNA+PTEN-mimic組PTEN蛋白表達水平下調。見圖4。miR-214-siRNA組和miR-214-siRNA+PTEN-mimic組MGC-802細胞株細胞增殖率為0.71±0.11和0.32±0.06，48 h后穿膜細胞數分別為(164.69±12.09)和(62.30±5.29)個。miR-214-siRNA+PTEN-mimic組MGC-802細胞株細胞增殖率高于miR-214-siRNA組，穿膜細胞數多于miR-214-siRNA組(P<0.05)。見圖5。

圖4 PTEN對胃癌細胞株PTEN蛋白表達水平影響

圖5PTEN對胃癌細胞侵襲能力的的影響(結晶紫染色×40)

3 討論

最近很多研究指出，表達失調的miRNA在各種類型的人類惡性腫瘤中起重要作用，miRNAs表達水平或活性的改變可能會通過調節多種類型靶基因表達誘導腫瘤的發生和發展[15-16]。因此，研究特異性miRNA及其在惡性腫瘤發生、發展過程中的具體作用及機制可以為惡性腫瘤的診斷及治療提供理論支持和意見，也是目前腫瘤學領域較熱門的研究方向。

miRNA是近年來新發現的一類小分子非編碼RNA，其在細胞的增殖、凋亡、分化及遷移、侵襲等方面發揮著重要的作用，越來越多的研究指出miRNA在惡性腫瘤的發生、發展中扮演著重要的角色[17]。而關于miRNA在胃癌進展過程中的具體作用和相關機制及對胃癌診斷和治療的指導應用也進行了很多基礎研究，為胃癌的基因診斷和治療提供了新靶點及研究方向。Wang等[17]研究指出，miR-214在胰腺癌中呈現高表達狀態，miR-214可通過抑制ING4靶基因的表達調控胰腺癌細胞對化療藥物的敏感性。Wen等[18]研究發現，miR-214在宮頸癌組織中表達明顯下調，而miR-214的表達水平與宮頸癌細胞株的遷移、侵襲能力有關，且與患者的臨床預后呈負相關，其可能是通過抑制下游相關靶基因進行調控。曾有研究報道指出miR-214可以作為新的潛在治療靶點對胃癌進行靶向治療[19]。也有研究指出miR-214可通過靶向PTEN蛋白的表達誘導卵巢癌細胞對順鉑耐藥，降低卵巢癌患者對順鉑的化療耐藥性[20]。前期部分研究已表明，miR-214與胃癌具有一定的相關性，但miR-214在胃癌發生、發展過程中的作用靶標和具體作用機制目前尚不清楚。所以本研究對胃癌組織和細胞株中miR-214表達情況及其在細胞生物學行為中的具體作用機制進行了探討。本研究結果顯示，與癌旁正常胃組織比較，miR-214表達水平在胃癌組織中明顯上調，表明miR-214表達水平與胃癌患者的臨床進展可能具有一定的相關性，與Yang等[21]的研究報道一致。因此，推測miR-214在胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲等行為中起到關鍵的調控作用。本研究通過生物信息學網站預測miR-214的靶基因，結果發現PTEN蛋白的3'UTR位點序列和miR-214位點序列有直接相關性，且miR-214可以直接調控PTEN的表達水平和活性。

PTEN是蛋白酪氨酸磷酸酶的同系物，其位于人染色體10q23區域，其在多種類型的腫瘤中扮演腫瘤抑制因子的角色[22]。據研究報道，PTEN可以干擾細胞的凋亡、增殖、遷移和侵襲等行為，以及通過影響血管生成信號通路的激活達到抑制腫瘤生長的作用[23-24]。最近有研究顯示，上調PTEN蛋白的表達可以增加Caspase-3的表達，進而減緩腫瘤細胞的凋亡行為[25]。研究miR-214和PTEN在胃癌中的作用方式及對胃癌細胞生物學行為的影響是本實驗的重點。本研究結果顯示，抑制miR-214后，PTEN蛋白表達水平下調，胃癌MGC-803細胞的增殖能力和侵襲行為均受到一定程度的抑制，而同時增加PTEN蛋白的表達水平后，miR-214對胃癌MGC-803細胞增殖和侵襲行為的抑制在一定程度得到逆轉，即MGC-803細胞的增殖和侵襲能力增強，表明PTEN在一定程度可與miR-214形成負反饋作用。二者共同調控胃癌細胞的生物學行為。

綜上所述，本實驗證明了miR-214在胃癌中呈現過表達狀態，較低miR-214可顯著抑制胃癌細胞的增殖和侵襲能力，miR-214和PTEN蛋白共同作用參與胃癌細胞的生物學行為的調控，但是是否有下游相關信號通路參與miR-214/PTEN的調控過程尚不清楚，擬下一步實驗進行研究探討。本實驗為miR-214/PTEN在胃癌細胞的作用方式和機制的闡釋提供了一定的理論支持，也為胃癌的診斷和治療方向提供了新的基因靶點可能。

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